三角褐指藻三?；视秃铣上嚓P(guān)基因的功能驗證.pdf

1、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)已完成基因組測序,具備成熟的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),是海洋硅藻的模式種。由于其生長快、油脂含量高(占細胞干重的20％～50%),具備大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)基礎(chǔ),已成為微藻生物柴油研究的理想材料。本文對其三?；视?TAG)合成的關(guān)鍵基因進行了克隆,并在相應(yīng)酵母缺陷型菌株中開展了功能驗證,進一步構(gòu)建了硅藻表達載體,完成了基因槍轉(zhuǎn)化,取得進展如下:
　　1.通過RT-PCR方法從三角褐指

2、藻總cDNA中克隆得到磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶1(PtGPAT1)基因的完整cDNA序列,通過與基因組序列比較分析,發(fā)現(xiàn)該基因序列全長1947bp,編碼648個氨基酸,基因組全序列共有5個外顯子和4個內(nèi)含子,利用信息學(xué)方法分析共有6個跨膜結(jié)構(gòu),分析該GPAT定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
　　2.針對PtGPAT1與實驗室之前克隆的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2基因(PtDGAT2),構(gòu)建了酵母表達載體pYGPAT1與pYDGAT2,導(dǎo)入后分別在2株GPAT(Y

3、13037、Y15983)和1株DGAT(H1246)缺陷型酵母菌株中進行相關(guān)基因的功能驗證。尼羅紅染色觀察顯示,PtGPAT1在2種酵母缺陷型轉(zhuǎn)化子中的相對熒光值均顯著高于轉(zhuǎn)化空白載體的對照組,證明PtGPAT1重組表達蛋白具備磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性。而PtDGAT2不能使DGAT缺陷性釀酒酵母H1246回復(fù)突變,提示不具備二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶功能。
　　3.針對PtDGAT2與實驗室之前在酵母中已驗證功能的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶4(

4、PtDGAT4),構(gòu)建了硅藻表達載體pfcpA-DGAT2/pfcpB-Bar和pfcpA-DGAT4/pfcpB-Bar,并完成了基因槍轉(zhuǎn)化,后續(xù)抗性藻株的篩選與檢測實驗正在進行中。
　　本文首次對三角褐指藻的GPAT基因完成功能驗證,相對熒光值半定量結(jié)果顯示,PtGPAT1可以顯著提高酵母缺陷型菌株中的TAG含量,提示PtGPAT1可以作為三角褐指藻油脂代謝基因工程的重要靶基因。構(gòu)建了PtDGAT2與PtDGAT4的硅藻轉(zhuǎn)化載