利用毛細(xì)管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)鑒定常見(jiàn)血液感染病原菌的研究.pdf

1、背景隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程的加快及HIV感染人群的增多,免疫力低下群體的范圍也在不斷擴(kuò)大。每年有大量的患者死于血液感染[1,2],尤其是因敗血癥導(dǎo)致的新生兒死亡[3]。據(jù)全國(guó)醫(yī)院感染監(jiān)控網(wǎng)的報(bào)告顯示,菌血癥的發(fā)病率在醫(yī)院內(nèi)感染中的構(gòu)成比為1.3％,發(fā)病率為48.56/10萬(wàn)[4]。在美國(guó)因血液感染所致的敗血癥是導(dǎo)致病人死亡的十大原因之一[5]。因此,及時(shí)診斷感染病原菌并給予抗菌治療,是降低死亡率的重要一步。培養(yǎng)法作為細(xì)菌診斷的金標(biāo)準(zhǔn),耗時(shí)長(zhǎng)

2、,操作繁瑣,對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌難以檢出(如肺炎鏈球菌等),而且易受抗生素的影響,常導(dǎo)致某些細(xì)菌無(wú)法生長(zhǎng)。因此探索建立一種快速檢測(cè)血液中的微量病原菌的方法成為亟待解決的問(wèn)題。細(xì)菌的核糖體小亞基rRNA是近年來(lái)進(jìn)行細(xì)菌分類和鑒定研究的熱點(diǎn),為病原菌的分子生物學(xué)快速檢測(cè)提供了理想靶點(diǎn)[6-9]。
　　 20世紀(jì)80年代,在傳統(tǒng)平板凝膠電泳(slab gel electrophoresis,SGE)的基礎(chǔ)上發(fā)展了毛細(xì)管電泳技術(shù)(ca-p

3、illary electrophoresis,CE),用于快速分離生物大分子。Orita等[10]在同期發(fā)展了用于基因分型的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù)(single strand conformationpolymorphism,SSCP)。后來(lái),Kuypers等[11]將兩項(xiàng)技術(shù)相結(jié)合形成了CE-SSCP來(lái)進(jìn)行基因的突變分析。由于該技術(shù)具有樣品用量少、靈敏度高、分析能力強(qiáng)、定量性能好等諸多優(yōu)點(diǎn),在生命科學(xué)中已被廣泛應(yīng)用于基因突變檢測(cè)、PC

4、R產(chǎn)物分析、SNP的快速分型以及mRNA定量[12]、抗菌活性分析[13]等。本研究利用通用引物PCR,結(jié)合毛細(xì)管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù)(CE-SSCP)對(duì)常見(jiàn)的血液感染病原菌:金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌進(jìn)行了檢測(cè),進(jìn)而建立了一種快速檢測(cè)常見(jiàn)血液感染病原菌的方法。
　　 方法1.經(jīng)查閱文獻(xiàn),選取常見(jiàn)血液感染病原菌:金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、表皮

5、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌為研究對(duì)象,通過(guò)NCBI查詢其全基因組序列,利用ClustalX1.81軟件進(jìn)行多重序列比對(duì),查找16SrDNA、23S rDNA基因序列的保守區(qū)域,在此保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物。2.提取上述病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA后,分別對(duì)16S rRNA基因和16S-23S rRNA間區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后進(jìn)行CE-SSCP分析,建立標(biāo)準(zhǔn)菌株的CE-SSCP圖譜并進(jìn)行機(jī)器碼識(shí)別。同時(shí)對(duì)該方法的敏感度進(jìn)行研究

6、。3.收集臨床菌株進(jìn)行CE-SSCP分析,所獲得的圖譜與所建立的標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜進(jìn)行比較驗(yàn)證。同時(shí)將CE-SSCP法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果1.在16S rDNA和23S rDNA的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的通用引物,能夠一次對(duì)所研究的七種病原菌進(jìn)行擴(kuò)增,且片段長(zhǎng)度與實(shí)際相符合,條帶結(jié)果清晰,未見(jiàn)明顯的非特異性擴(kuò)增條帶和引物二聚體。2.16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)CE-SSCP分析,七種病原菌具有不同的等位片段長(zhǎng)度(Cv≤0.0

7、46％)和出峰時(shí)間點(diǎn)(Cv≥1.33％):前者重復(fù)性由于后者。經(jīng)多次測(cè)量計(jì)算出其等位片段長(zhǎng)度范圍為:金黃色葡萄球菌(317.40-317.61),大腸桿菌(309.83-309.99),銅綠假單胞菌(305.30-305.59),表皮葡萄球菌(316.34-316.63),肺炎克雷伯菌(307.76-307.96),糞腸球菌(327.28-327.57),肺炎鏈球菌(315.86-315.62)。16S-23S rDNA間區(qū)經(jīng)分析后,也

8、呈現(xiàn)不同的CE-SSCP圖譜,其圖譜經(jīng)機(jī)器碼識(shí)別,可使細(xì)菌的差異鑒別更加快捷。3.對(duì)七種血液感染病原菌臨床菌株進(jìn)行檢測(cè),所有細(xì)菌都在所建立的等位片段長(zhǎng)度范圍之內(nèi)。該法與培養(yǎng)法的符合率為94.8％,敏感度達(dá)18 CFU/ml。
　　 結(jié)論1.所設(shè)計(jì)的通用引物能夠一次對(duì)所研究的七種病原菌進(jìn)行擴(kuò)增,且條帶結(jié)果清晰,未見(jiàn)明顯的非特異性條帶和引物二聚體。2.16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)CE-SSCP分析,可同時(shí)對(duì)七種病原菌進(jìn)行鑒定,