代謝工程改造釀酒酵母生物合成類胡蘿卜素的研究.pdf

1、釀酒酵母是異源合成天然產(chǎn)物的重要宿主，但是在釀酒酵母中構(gòu)建遺傳穩(wěn)定性好、基因表達可控的代謝途徑仍然是代謝工程和合成生物學中的一大挑戰(zhàn)。類胡蘿卜素是具有抗氧化、防癌等功效的高附加值四萜類化合物。本文以開發(fā)代謝途徑組裝工具和策略為基礎(chǔ)，結(jié)合代謝途徑基因的表達調(diào)控，關(guān)鍵酶的定向進化等技術(shù)，對在釀酒酵母中構(gòu)建高效的β-胡蘿卜素和番茄紅素生物合成途徑進行了研究。
　　首先，從紅法夫酵母cDNA中克隆了CrtE、Crt YB和CrtI三個基因

2、，并將其按照傳統(tǒng)的代謝途徑方法在高拷貝的2μ附著型載體上進行了表達，獲得了能合成β-胡蘿卜素的重組菌株。由于該方法構(gòu)建的菌株遺傳不穩(wěn)定，我們探索了其它策略，以實現(xiàn)代謝途徑在基因組中的組裝。
　　為了能將長的代謝途徑有效地整合進釀酒酵母的基因組中，研究中構(gòu)建了一套基于Cre/loxP重組系統(tǒng)的pMRI載體。經(jīng)過測試，該套載體在循環(huán)使用時其選擇標記區(qū)段lox P-KanMX-p BR322ori-loxP的pop-out效率達到70％

3、，可以有效地用于代謝途徑中相關(guān)基因的分步整合?；谒鶚?gòu)建的載體工具，我們提出了代謝途徑的分散式整合策略（Decentralized assembly）。同時為了使所構(gòu)建的代謝途徑中的基因表達可以受到外部條件控制，對釀酒酵母的GAL調(diào)控系統(tǒng)進行了改造，敲除了其中的GAL80基因，使GAL啟動子所控制的基因表達可以受到外界葡萄糖濃度的調(diào)控。將兩個拷貝的Crt YB和CrtI以及一個拷貝的CrtE和tHMG1，共6個ORF整合到酵母基因組中，

4、并利用改造后的GAL調(diào)控系統(tǒng)對上述基因的表達進行控制，所得到的重組釀酒酵母菌株在搖瓶中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量達到了11 mg/g DCW(72.57mg/L)。通過20代的連續(xù)培養(yǎng)，證實了所構(gòu)建代謝途徑的遺傳穩(wěn)定性。
　　代謝前體物質(zhì)的平衡利用是提高目標代謝物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。通過建立以類胡蘿卜素顏色為指示的啟動子強度表征系統(tǒng)，對一系列不同強度的啟動子進行了篩選，其中強啟動子被用于基因的過表達，而弱啟動子則用于旁側(cè)代謝途徑的下調(diào)。結(jié)合組

5、成型和誘導型β-胡蘿卜素合成途徑以及HXT1啟動子控制的角鯊烯合成途徑，對節(jié)點物質(zhì)FPP的上游、下游和旁側(cè)基因的表達進行了順序控制。通過上述策略構(gòu)建出了總類胡蘿卜素產(chǎn)量高達20.79mg/g DCW(1156mg/L)的釀酒酵母菌株。該菌株與實驗中最初構(gòu)建的僅僅整合了Crt YB和CrtI基因的菌株相比，其單位細胞干重中總類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了約700倍。同時，實時熒光定量PCR證實了在發(fā)酵過程中代謝途徑中各基因的表達是以預期的順序進行

6、。
　　此外，為了構(gòu)建能高效合成番茄紅素的菌株，研究中采用定向進化的方法對合成途徑中的關(guān)鍵酶進行了逐個改造。其中，通過對CrtYB基因編碼的雙功能酶的環(huán)化酶功能區(qū)域進行定向進化，得到了環(huán)化酶失活，但八氫番茄紅素合酶功能域保留完好的突變體CrtYB11M;對CrtE基因定向進化得到了表達量提高的正突變CrtE03M。與野生型相比，突變體CrtE03M在基因組上的表達使得番茄紅素的產(chǎn)量提高了1.16倍。然后，通過調(diào)節(jié)不同Crt基因的拷