急性應(yīng)激對老齡鼠術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能的影響及機制研究.pdf

1、目的:術(shù)后認知功能障礙(POCD)是指外科手術(shù)麻醉后發(fā)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，表現(xiàn)為患者術(shù)后出現(xiàn)意識、認知、定向、思維、記憶以及睡眠等方面的紊亂?，F(xiàn)發(fā)病機制尚不明確，但與高齡，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)和應(yīng)激刺激均相關(guān)。臨床中急診手術(shù)的患者不占少數(shù)，他們在入院接受手術(shù)之前均受到外傷，車禍、劇烈疼痛等急性應(yīng)激刺激，這種情況對于手術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能會造成什么影響呢？越來越多的證據(jù)表明應(yīng)激刺激加重了機體對后續(xù)外周免疫應(yīng)激產(chǎn)生的促炎反應(yīng)。本實驗的目的便

2、是探究急性應(yīng)激預(yù)刺激是否會加重術(shù)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)，延遲術(shù)后空間學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)并探尋其中機制。
　　研究方法:所有實驗動物（雄性老年SD大鼠共288只）隨機分為8組，分別為對照組(C)(n=60)、刺激組(IS)(n=60)、手術(shù)組(S)(n=36)、刺激+手術(shù)組(IS+S)(n=36)、皮質(zhì)酮組(CORT)(n=42)、皮質(zhì)酮+手術(shù)組（CORT+S）(n=18)、刺激+米非司酮組(IS+RU486)(n=18)、刺激+米

3、非司酮+手術(shù)組(IS+RU486+S)(n=18)。部分實驗動物于手術(shù)前或刺激前連續(xù)6天進行Morris水迷宮定向航行學(xué)習(xí)實驗。C組SD大鼠不做任何特殊處理。需要應(yīng)激刺激的實驗鼠在進行6天Morris水迷宮定向航行實驗后，于第7天進行不可避免的尾刺激(inescapable tailshock，IS)。需要手術(shù)的實驗鼠均于第8天（刺激后24小時）行肝部分切除術(shù)。CORT組和CORT+S組SD大鼠在連續(xù)6天進行Morris水迷宮定向航行學(xué)

4、習(xí)實驗后，第7天進行皮下注射皮質(zhì)酮2.5mg/kg，需要手術(shù)的實驗鼠于24小時后行肝部分切除術(shù)。IS+RU486組和IS+RU486+S組的SD大鼠在進行6天Morris水迷宮定向航行實驗后，于第7天進行不可避免的尾刺激，刺激后立刻雙下肢多點肌注米非司酮(RU486)30mg/kg，需要手術(shù)的實驗鼠于24小時后行肝部分切除術(shù)。所有實驗動物于術(shù)后或刺激后第1、3、7天行翻轉(zhuǎn)水迷宮測試并處死獲得標(biāo)本。在各個對應(yīng)時間點我們檢測炎性因子IL-1

5、β和IL-6，膠質(zhì)細胞激活相關(guān)指標(biāo)Iba-1、GFAP和CD200，糖皮質(zhì)激素。
　　結(jié)果:第一部分:利用翻轉(zhuǎn)Morris水迷宮實驗來測驗經(jīng)過手術(shù)或者應(yīng)激刺激處理后的老齡鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力。通過對結(jié)果的統(tǒng)計分析我們得出以下結(jié)論，單獨接受應(yīng)激刺激的實驗鼠跟C組的實驗鼠相比，各個時間點相比并沒有明顯的潛伏期延長（圖2A，p＞0.05）。然而，S組的實驗鼠和IS+S組的實驗鼠均明顯損害了術(shù)后第1天和第3天的空間學(xué)習(xí)記憶能力。刺激復(fù)合手

6、術(shù)的實驗刺激相對于單獨的手術(shù)刺激會導(dǎo)致術(shù)后第3天更為顯著的潛伏期延長（圖2A，p＜0.05）。所有組的空間記憶能力均在術(shù)后第7天恢復(fù)至正常對照組水平。各組在游泳速度方面均沒有明顯差異，提示部分實驗鼠尋找平臺所需時間的延長并不是由于實驗鼠的體能差異而來。因此綜上所述，Morris水迷宮結(jié)果提示應(yīng)激刺激增強了手術(shù)刺激造成術(shù)后空間學(xué)習(xí)記憶能力的損害。
　　第二部分:我們在研究急性應(yīng)激和手術(shù)創(chuàng)傷對老齡鼠行為學(xué)變化的基礎(chǔ)上，用ELISA方法

7、進一步定量檢測老齡鼠海馬區(qū)炎性因子IL-1β和IL-6含量的變化。利用雙因素方差分析海馬區(qū)炎性因子表達顯示，單獨給予急性應(yīng)激預(yù)刺激在術(shù)后第1、3和7天均沒有導(dǎo)致海馬區(qū)IL-1β的升高（圖3A，p＞0.05）。S組實驗鼠和IS+S組實驗鼠IL-1β在術(shù)后第1天和第3天表達均比對照組明顯增高（圖3A，p＜0.01）。并且于術(shù)后第3天，我們觀察到IS+S組實驗鼠的IL-1β明顯高于S組的實驗鼠(圖3A，p＜0.05)，這就證明了提前接受急性應(yīng)

8、激刺激可以增強后續(xù)手術(shù)導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。所有升高的促炎因子于術(shù)后第7天回歸到術(shù)前的基線水平。在IL-6的表達變化上我們發(fā)現(xiàn)了與IL-1β同樣的趨勢（圖3B，p＜0.01）。
　　我們利用免疫熒光的方法檢測Iba-1，以探究小膠質(zhì)細胞的激活情況。急性應(yīng)激刺激后24小時，IS組實驗鼠的Iba-1表達水平明顯比C組實驗鼠的Iba-1增高(圖4A，A'，B，B'，E，p＜0.05)。S組和IS+S組實驗鼠在術(shù)后第1天，Iba-1的表達水平均

9、明顯上升（圖4E，p＜0.01，p＜0.01）。除此之外，我們還觀察到在接受手術(shù)之間提前接受急性刺激的實驗鼠的Iba-1表達水平在術(shù)后第3天出現(xiàn)明顯的額外升高（圖4C，C'，D，D'，E，p＜0.01），這就證明了急性應(yīng)激刺激和手術(shù)創(chuàng)傷對于小膠質(zhì)細胞的激活上起著明顯的協(xié)同作用。所有實驗鼠的Iba-1水平在術(shù)后第7天均回到了基線水平。為了探究應(yīng)激刺激導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞激活的潛在機制，我們還利用Real-time PCR的方法檢測CD200(c

10、luster of differentiation200)含量的變化。我們檢測到跟C組相比，IS組實驗鼠的CD200mRNA的表達水平在刺激后24小時明顯下調(diào)（圖5，p＜0.05）。術(shù)后第1天，我們發(fā)現(xiàn)無論實驗鼠提前是否接受了急性應(yīng)激刺激，手術(shù)創(chuàng)傷均明顯下調(diào)了腦內(nèi)海馬區(qū)CD200的表達（圖5，p＜0.01，p＜0.01），并且這種下降在術(shù)后第7天均恢復(fù)至正常水平。除此之外，我們觀察到在術(shù)后第3天，跟S組的實驗鼠相比，應(yīng)激刺激和手術(shù)創(chuàng)傷的

11、結(jié)合嚴(yán)重的導(dǎo)致了CD200表達的降低（圖5，p＜0.01）。
　　我們利用免疫熒光的方法來檢測GFAP，以探究星形膠質(zhì)細胞在受到手術(shù)創(chuàng)傷和應(yīng)激刺激時是否會被激活。免疫熒光的結(jié)果顯示，應(yīng)激刺激后24小時，相對于C組相比，IS組GFAP的表達并沒有因為接受了應(yīng)激刺激而增加(圖6A，A'，B，B'，G，p＞0.05)。盡管S組和IS+S組的實驗鼠GFAP的表達在術(shù)后第1天和術(shù)后第3天均明顯上升（圖6C，C'，D，D'，E，E'，F(xiàn)，F(xiàn)'

12、，G，p＜0.01），但是跟S組的實驗鼠相比，提前接受了應(yīng)激刺激的實驗鼠在任何時間點的GFAP表達都并沒有比單獨手術(shù)的實驗鼠增高（圖6G，p＞0.05）。
　　第三部分:我們將C組、IS組和CORT組實驗鼠進行了刺激前、刺激后24h、48h和72h外周取血，利用ELISA檢測刺激前后皮質(zhì)酮的變化。我們發(fā)現(xiàn)實驗鼠在接受刺激后，其體內(nèi)皮質(zhì)酮的含量與對照組相比明顯上升（圖7，p＜0.01和p＜0.05）。體內(nèi)皮質(zhì)酮的濃度在刺激后24小時

13、最高，隨后的48小時逐漸下降，于刺激后72小時回落至基線水平。而給予皮下注射CORT的實驗鼠，其體內(nèi)皮質(zhì)酮的變化與IS組實驗鼠相同。
　　我們發(fā)現(xiàn)IS+RU486組和CORT組均與C組和IS組相類似，并沒有使刺激后海馬區(qū)的炎性因子IL-1β（圖8A，p＞0.05）和IL-6（圖8B，p＞0.05）表達上調(diào)。IS+RU486+S組實驗鼠同S組實驗鼠類似，在術(shù)后第1天和第3天其海馬區(qū)炎性因子IL-1β和IL-6水平均明顯上調(diào)，術(shù)后第7

14、天下降至正常水平（圖9A、B，p＜0.01）。CORT+S組同IS+S組類似，不僅術(shù)后第1天和第3天炎性因子水平上升至第7天回落，我們還發(fā)現(xiàn)IS+RU486+S組與IS+S組相比，在術(shù)后第3天炎性因子水平明顯下降（圖9A、B，p＜0.01）;S組與CORT+S組相比，其術(shù)后第3天炎性因子的表達水平也明顯下降（圖9A、B，p＜0.01）。
　　利用翻轉(zhuǎn)Morris水迷宮實驗以測驗各組實驗鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力。我們在應(yīng)激刺激后立刻肌注

15、糖皮質(zhì)激素受體阻滯劑(RU486)的實驗鼠，即IS+RU486組實驗鼠在尋找水池中平臺所花費的時間與C組實驗鼠沒有明顯差異（圖11A，p＞0.05），同樣的現(xiàn)象我們也發(fā)現(xiàn)在CORT組實驗鼠（圖11A，p＞0.05）。IS+RU486+S組實驗鼠同S組實驗鼠類似，在術(shù)后第1天和第3天其空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損，潛伏期明顯延長。CORT+S組同IS+S組類似，不僅術(shù)后第1天和第3天潛伏期明顯延長，我們還發(fā)現(xiàn)IS+S組與IS+RU486+S組

16、相比，在術(shù)后第3天潛伏期增加(圖12A，p＜0.01);CORT+S組與S組相比，其術(shù)后第3天潛伏期也明顯增加（圖12B，p＜0.05）。
　　結(jié)論:1.急性應(yīng)激預(yù)刺激延遲了老齡鼠術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)。
　　2.急性應(yīng)激預(yù)刺激可引起老齡鼠術(shù)后腦內(nèi)海馬區(qū)炎性因子（IL-1β和IL-6）表達增加，小膠質(zhì)細胞激活增加。
　　3.急性應(yīng)激刺激可引起老齡鼠刺激后24小時腦內(nèi)海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞激活增加，對海馬區(qū)炎性因子表達和學(xué)習(xí)記