急性應(yīng)激對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠腦淀粉樣病變影響的研究.pdf

1、牛海綿樣腦病 (boyine spongifom encephalopathy，BSE)、人的變異性克-雅氏病(Creuzfeldt Jakob Disease)、阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)及綿羊瘙癢病(Scrapie)，是動(dòng)物和人常見(jiàn)的一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾??；其主要病理特征為腦部組織發(fā)生淀粉樣病變。淀粉樣蛋白假說(shuō)認(rèn)為β淀粉樣蛋白(amyloid-β，A β)的積累是這類海綿樣腦病的固有特征和發(fā)病的

2、主要原因。 Aβ的產(chǎn)生是由β淀粉樣前體蛋白 (amyloidprecursor protein，APP) 經(jīng)過(guò)β-分泌酶(β-secretase)和γ-分泌酶(γ-secretase)順序剪切；其中γ-分泌酶的剪切作用尤為關(guān)鍵。腦淀粉樣病變的分型較多，例如AD的發(fā)生分為散發(fā)型和家族型兩類，絕大部分AD病例是散發(fā)型，主要由遺傳和環(huán)境等多種因素綜合所致。目前，以研究遺傳因素影響γ-分泌酶的活性和檢測(cè)淀粉樣蛋白產(chǎn)生為主：而環(huán)境因素是否能影響γ

3、-分泌酶的活性和β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立急性應(yīng)激動(dòng)物模型，研究急性應(yīng)激因素影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦淀粉樣病變的發(fā)生與發(fā)展。主要研究?jī)?nèi)容如下： 1．急性應(yīng)激動(dòng)物模型建立根據(jù) Gene Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)公布中C-FOS基因序列，設(shè)計(jì)引物。以C57小鼠為研究材料，把小鼠放置于固定束縛裝置中，2小時(shí)后，從固定裝置中取出，急性應(yīng)激組小鼠表現(xiàn)為疏毛增多，敏感、煩躁，易激怒，毛發(fā)蓬松，缺乏光澤。處死小鼠，在冰上取小鼠肝臟，提取總

4、RNA，經(jīng)RT-PCR獲得cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，并據(jù)其結(jié)果計(jì)算比較應(yīng)激組與對(duì)照組小鼠肝臟中C-FOS基因的mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性應(yīng)激組的小鼠肝臟中C-FOS基因的mRNA水平是對(duì)照組的4倍。 2．夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)急性應(yīng)激C57小鼠海馬中Aβ水平對(duì)C57小鼠進(jìn)行急性應(yīng)激后，在冰上采集小鼠海馬，提取海馬組織蛋白，然后ELISA檢測(cè)急性應(yīng)激后小鼠海馬組織中Aβ水平；同時(shí)設(shè)有陰性對(duì)照和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，在波長(zhǎng)為Em

5、=495nm下，M5酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光底物受到激發(fā)產(chǎn)生的熒光值。通過(guò)陽(yáng)性蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出，急性應(yīng)激組小鼠海馬中Aβ<,40>和Aβ<,42>的濃度分別為1.68和1.7nmol/L；而對(duì)照組小鼠海馬中Aβ<,40>和Aβ<,42>的濃度分別為1.01和1.0nmol/L?？梢?jiàn)急性應(yīng)激小鼠的海馬組織中無(wú)論是Aβ<,40>還是Aβ<,42>的水平，都顯著高于對(duì)照組(p<0.01)；然而，用同樣的方法檢測(cè)小鼠前額葉皮層中Aβ<,40>和Aβ

6、<,42>的水平，則發(fā)現(xiàn)在急性應(yīng)激組和對(duì)照組小鼠的前額葉皮層中Aβ<,40>和Aβ<,42>的濃度同為1.0 nmol/L左右，無(wú)顯著性差異。 3．熒光底物實(shí)驗(yàn)測(cè)定應(yīng)激C57小鼠海馬組織中γ-分泌酶的活性取急性應(yīng)激小鼠的海馬和前額葉皮層并組織勻漿，低速離心，取上層液，蛋白定量后，用胰島素針將細(xì)胞膜抽吸6至8次，機(jī)械破碎細(xì)胞膜，然后15，000rpm/min離心，棄上清液，向沉淀物加入熒光底物的緩沖液，37℃水浴2小時(shí)后，在波長(zhǎng)E

7、x=355nm，Em=440nm下，M5酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值，并對(duì)產(chǎn)物激發(fā)熒光進(jìn)行計(jì)量。急性應(yīng)激組小鼠海馬中γ-分泌酶熒光值為95.4；對(duì)照組小鼠海馬中γ-分泌酶熒光值為65.2；而空白對(duì)照(無(wú)蛋白，僅有熒光底物)的熒光值為53.7。故急性應(yīng)激組小鼠海馬中γ-分泌酶的活性比對(duì)照組小鼠海馬中γ-分泌酶的活性增強(qiáng)約60％。同樣方法檢測(cè)了急性應(yīng)激組小鼠和對(duì)照組小鼠的前額葉皮層中γ-分泌酶的熒光值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的熒光值均約為60.3。表明急性應(yīng)急對(duì)

8、小鼠前額葉皮層中的γ-分泌酶的活性沒(méi)有明顯影響。為驗(yàn)證急性應(yīng)激是否僅僅是通過(guò)改變?chǔ)?分泌酶的活性來(lái)調(diào)控Aβ的產(chǎn)生，因此，本試驗(yàn)同樣利用熒光底物試驗(yàn)檢測(cè)α-分泌酶與β-分泌酶的活性。結(jié)果顯示，無(wú)論是應(yīng)激組和對(duì)照組的海馬中還是在前額葉皮層中，α-分泌酶與β-分泌酶的活性都沒(méi)有明顯的變化。 4．Western blot檢測(cè)急性應(yīng)激C57小鼠海馬組織中tau蛋白的磷酸化水平C57小鼠經(jīng)急性應(yīng)激后，在冰上取小鼠海馬組織，用抽提組織蛋白的試劑盒，提

9、取蛋白，對(duì)提取的蛋白進(jìn)行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳；然后將經(jīng)過(guò)凝膠分離的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用抗磷酸化tau蛋白抗體進(jìn)行Western blot，檢測(cè)小鼠海馬中蛋白中的磷酸化水平。經(jīng)Adobe Photo shop軟件統(tǒng)計(jì)Western blot結(jié)果，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，急性應(yīng)激小鼠海馬中磷酸化tau蛋白的條帶的灰度值為4.56；而對(duì)照組小鼠海馬中磷酸化tau蛋白的條帶的灰度值為1.48，急性應(yīng)激組小鼠海馬tau蛋白的磷酸化水平是對(duì)照組的