小鼠Dlk1-Dio3印記區(qū)域內(nèi)一個(gè)新的差異甲基化區(qū)的表觀遺傳學(xué)分析.pdf

1、小鼠Dlk1-Dio3印記區(qū)域位于12號(hào)染色體末端（12qF1），包含三個(gè)父本表達(dá)的蛋白編碼基因和多個(gè)母本表達(dá)的長(zhǎng)非編碼RNA基因，以及大量的miRNAs和核仁內(nèi)小RNA（snoRNAs）。已知這一印記區(qū)域內(nèi)有三個(gè)父本甲基化的差異甲基化區(qū)（IG-DMR、Gtl2-DMR和Dlk1-DMR）。miR-341和miR-1188是兩個(gè)前體序列相距226 bp的miRNA，位于這一印記區(qū)域內(nèi)Meg8的第二內(nèi)含子中。已有研究表明，腺相關(guān)病毒載體在

2、miR-341附近區(qū)域的定點(diǎn)整合會(huì)導(dǎo)致上、下游的長(zhǎng)非編碼RNA基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生；而Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子也會(huì)特異地插入到miR-341的上下游區(qū)域并引起突變，使附近基因的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)肝癌的發(fā)生。這說(shuō)明miR-341附近的插入突變會(huì)導(dǎo)致上下游基因的表達(dá)失調(diào)，暗示著miR-341的附近可能存在重要的DNA調(diào)控序列。CpG島的預(yù)測(cè)表明miR-341和miR-1188的附近存在兩個(gè)CpG島（命名為CGI-1

3、和CGI-2），其中CGI-1覆蓋了miR-341的前體序列，CGI-2位于miR-1188下游約800 bp處。本文以小鼠Dlk1-Dio3區(qū)域內(nèi)的miR-341/miR-1188和CGI-1/CGI-2為研究對(duì)象，分析了DNA甲基化在發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化、組蛋白修飾的分布以及鋅指蛋白CTCF在這一區(qū)域的結(jié)合情況，并構(gòu)建載體分析了新的差異甲基化區(qū)CGI-2的絕緣子活性。
　　首先，本研究分析了miR-341和miR-1188的表

4、達(dá)譜和印記狀況。原位雜交的結(jié)果顯示它們的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本在E15.5天具有相似的表達(dá)模式，主要表達(dá)于腦、舌、肺、肝、胸腺、椎體軟骨等部位；定量PCR的結(jié)果表明miR-341和miR-1188的成熟體在舌和肝中有較高的表達(dá)，腦和肺次之，腎中的表達(dá)較低，與初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)模式是一致的；印記分析表明miR-341和miR-1188是兩個(gè)母本表達(dá)的miRNAs。
　　其次，本研究分析了CGI-1和CGI-2的DNA甲基化模式及其在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)

5、程中的動(dòng)態(tài)變化。亞硫酸鹽測(cè)序分析表明CGI-2在E15.5和E18.5天的各組織中是一個(gè)母本甲基化的差異甲基化區(qū)；CGI-2在精子和卵細(xì)胞中都發(fā)生了高甲基化，在著床前的胚胎發(fā)育過(guò)程中逐漸去甲基化；著床后CGI-2發(fā)生了差異性的重新甲基化，它的母本等位快速地重新甲基化并一直維持高甲基化狀態(tài)，而其父本等位在部分地重新甲基化后再次發(fā)生去甲基化；CGI-2在E7.5天之前建立起差異甲基化模式。CGI-1雖然在囊胚中也發(fā)生了去甲基化，但在小鼠精子

6、、卵細(xì)胞、桑葚胚和著床后的胚胎中父母本都發(fā)生了高甲基化，并不具有等位差異性。
　　再次，本研究分析了差異甲基化區(qū)CGI-2及其上下游區(qū)域的組蛋白修飾的分布和CTCF的結(jié)合情況。ChIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，組蛋白修飾H3K9me3廣泛存在于CGI-2及其上下游區(qū)域；在肝臟中組蛋白修飾 H3K4me3和H3K9me3同時(shí)存在于CGI-2，但在胎盤(pán)中 CGI-2上只存在H3K9me3，缺乏激活性的H3K4me3。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明在CGI-

7、2及其上下游區(qū)域共存在四個(gè)高度保守的CTCF結(jié)合位點(diǎn)，但ChIP的結(jié)果顯示在小鼠肝臟和胎盤(pán)中CTCF實(shí)際上只結(jié)合于第三個(gè)位點(diǎn)，即只結(jié)合于差異甲基化區(qū)CGI-2。
　　最后，本研究構(gòu)建了絕緣子分析用的系列載體，初步分析了CTCF結(jié)合的差異甲基化區(qū)CGI-2的功能。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明CGI-2具有絕緣子的活性，且其絕緣子活性是依賴于CTCF結(jié)合位點(diǎn)的。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CGI-2是小鼠Dlk1-Dio3區(qū)域內(nèi)的