q-pcr講解..

1、唯我所欲、精準(zhǔn)溯源—qPCR實(shí)驗(yàn)解析,,北京全式金生物技術(shù)有限公司,2,qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法 qRT-PCR,概述,核酸提取cDNA 合成(兩步法 qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)方法和原則,樣品準(zhǔn)備,必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析,數(shù)據(jù)分析,3,qPCR基本概念,4,常規(guī)PCR與實(shí)時熒光定量PCR,常規(guī)PCR：借助電泳

2、對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終對起始模板進(jìn)行精確的定量分析,5,熒光定量PCR儀器工作原理,激發(fā)光發(fā)射源接收裝置PCR反應(yīng)模塊,qPCR 參數(shù): 擴(kuò)增曲線,擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線反映qPCR重要指標(biāo),qPCR 參數(shù): 溶解曲線,,溶解曲線(下左): 溫度和熒光值的關(guān)系，在擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行處理后溶解曲線 (下右): 溫度和熒光值的

3、關(guān)系，并取其導(dǎo)數(shù)，更為常用應(yīng)用:指示特異性，最為理想的為單峰；如出現(xiàn)多峰證明反應(yīng)不特異或存在引物二聚體,確認(rèn)反應(yīng)特異性，增加數(shù)據(jù)可信度,qPCR的數(shù)學(xué)原理,理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0×2n非理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時取對數(shù)得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n)整理方程式得:log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn將C(t)和

4、達(dá)到C(t)值時終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得：log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t) 初始濃度的對數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系,n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率,9,MIQE qPCR國際標(biāo)準(zhǔn),提出發(fā)表文章時所要求的最低限度的必要信息標(biāo)準(zhǔn)。對qPCR的術(shù)語；概念；研究與臨床應(yīng)用；樣本的采集、處理和制備；核酸的

5、質(zhì)量控制；反轉(zhuǎn)錄；qPCR過程；數(shù)據(jù)分析等方面的操作標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范都做了詳盡的闡述。,10,,qPCR常用定量方式,qPCR 常用實(shí)驗(yàn)方法,TaqMan® / TaqMan-MGB® Molecular BeaconSYBR Green I MGB EclipseTM Probes ScorpionsTMOthers...,qPCR 常用實(shí)驗(yàn)方法,簡單 成本較低,適用于多重PCR 特異性較好,可進(jìn)行SNP檢

6、測特異性非常好,熒光標(biāo)記方法選擇,醫(yī)療檢驗(yàn)TaqMan探針法特異準(zhǔn)確科研SYBR方法便宜方便TaqMan探針法要求嚴(yán)格的相對定量,14,,常用定量方法——相對定量vs絕對定量,絕對定量微生物檢測：病毒拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因檢測：轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)相對定量（差異）基因表達(dá)差異,16,qPCR常用試驗(yàn)方法,絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知濃度的RNA、質(zhì)?；蚝铣傻墓押塑账徭溕?；定量未知模板；標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品必須同時反應(yīng)；相對

7、定量 ??CT Method：使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因； 參照樣品基因與目的基因可以同時反應(yīng)，也可以單獨(dú)反應(yīng)； 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法：對每個樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達(dá)；,絕對定量,由標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算未知樣品的拷貝數(shù),利用管家基因校正并計(jì)算目的基因倍數(shù)關(guān)系,相對定量,一步法vs兩步法qPCR,qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)條件,可

8、進(jìn)行PCR或qPCR需要基因特異性引物高通量使用同類的RNA(i.e. single cell) 適合從大量的RNA樣本中得到少量基因（數(shù)目）的信息,先進(jìn)行cDNA合成再進(jìn)行PCR高效的第一鏈合成可為下游實(shí)驗(yàn)提供cDNA適合從少量的RNA樣本中得 到大量基因（數(shù)目）的信息,根據(jù)試驗(yàn)情況進(jìn)行選擇,21,qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法 qRT-PCR,概述,核酸提取cDNA 合成(兩步法 qRT-PC

9、R)引物設(shè)計(jì)方法和原則,樣品準(zhǔn)備,必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析,數(shù)據(jù)分析,22,核酸提取,RNA 提取,TransZol TransZol UpTransZol Plant EasyPure RNA K

10、itEasyPure Viral DNA/RNA Kit EasyPure Plant RNA KitEasyPure Blood RNA Kit TransZol Up Plus RNA KitEasyPure miRNA Kit,好的qPCR結(jié)果來源于高質(zhì)量的模板,DNA 提取,BloodZolPlantZolEasyPure Genomic DNA KitEasyPure Plant

11、 Genomic DNA KitEasyPure Blood Genomic DNA KitEasyPure Marine Genomic DNA KitEasyPure Bacteria DNA Kit,23,cDNA合成 (兩步法 qRT-PCR),好的qPCR結(jié)果依賴于成功的cDNA合成,反轉(zhuǎn)錄cDNA影響qPCR敏感度全長cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT): 只識別mRNA，合成cDNA序列靠近3

12、 ’隨機(jī)引物: 隨機(jī)合成序列，可能合成非編碼RNA，造成定量結(jié)果高估兩者混合結(jié)合兩者優(yōu)點(diǎn),24,絕對定量和相對定量實(shí)驗(yàn)要求,25,絕對定量,模板 盡可能選擇與目的基因序列相同以保證擴(kuò)增效率相同 來源 質(zhì)粒DNA 純化PCR產(chǎn)物 Reference DNA (genomic DNA) 精度 每次加樣要保證在2 μl以上，減少誤差 梯度 至少3個點(diǎn)，最好5個點(diǎn),26

13、,相對定量內(nèi)參基因選擇,內(nèi)參基因的作用 檢測樣本材料中RNA是否降解 糾正樣本加樣的差異 校正cDNA合成速率差異 校正PCR抑制劑的影響常用內(nèi)參基因 GAPDH β-actin 18SrRNA選擇 不同的物種選擇不同的內(nèi)參基因，有時候可選擇組合內(nèi)參基因。,27,,引物設(shè)計(jì)方法和原則,,Blast確定引物特異性,引物設(shè)計(jì),29,網(wǎng)絡(luò)免費(fèi)設(shè)計(jì)軟件,Primer3（primer3.ut.

14、ee） 引物和雙標(biāo)記水解探針的設(shè)計(jì) Tm的計(jì)算MFold（ http://mfold.rna.albany.edu） 引物和擴(kuò)增產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(delta G) 和融解溫度(Tm)BLAST（ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/） 結(jié)構(gòu)特異性,30,SYBR引物設(shè)計(jì)原則,SYBR-Green引物 引物長度18-30

15、bps，產(chǎn)物長度范圍100~400bp G/C 含量: 40-60% 避免引物內(nèi)含有互補(bǔ)序列 (尤其是3’端) 避免3’ 端錯配 3’端不能出現(xiàn)連續(xù)三個以上的G或C 避免3’端出現(xiàn)T堿基 設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物,31,TaqMan探針和引物設(shè)計(jì),32,qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法 qRT-PCR,概述,核酸提取cDNA 合成(兩步法 qRT-PCR)引物設(shè)

16、計(jì)方法和原則,樣品準(zhǔn)備,必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析,數(shù)據(jù)分析,33,,對照設(shè)置,34,對照設(shè)置,陰性對照Negative control: No template (NTC)Use: 檢驗(yàn)是否有模板污染No reverse transcriptase (NRT): Use: 檢驗(yàn)RNA樣品中是否有DNA污染No amplificatio

17、n control (NAC): Use: 檢驗(yàn)是否有聚合酶污染No probe control (NPC):Use: 檢驗(yàn)熒光污染Buffer: Only contains bufferUse: 檢驗(yàn)背景熒光陽性對照Calibrator: 可以用帶有PCR擴(kuò)增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸； 質(zhì)粒DNA；克隆到質(zhì)粒的cDNA；體外反轉(zhuǎn)錄的RNA；Reference RNA pools；來自于特定的生物體樣本的RNA或

18、DNA及國際上公認(rèn)的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物。Standard curve,35,,定量方式選擇,36,定量方式選擇,SYBR Green適用 -特異性要求不是特別高的反應(yīng)，分子數(shù)（拷貝數(shù)）超過1000的反應(yīng) -探針實(shí)驗(yàn)前，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn) -PCR條件非常成熟，無二聚體，無非特異擴(kuò)增TaqMan適用 -特異性要求較高的實(shí)驗(yàn) -多重PCR（標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)） -SNP -靈敏度要求較高的實(shí)驗(yàn),

19、標(biāo)準(zhǔn)曲線法和??Ct法,相對定量方法基因表達(dá)差異目的基因，內(nèi)參基因??Ct只依靠Ct值用于大通量（很多基因，如芯片結(jié)果）計(jì)算簡單估計(jì)性的結(jié)果要求目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率都比較好雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法結(jié)果精確對擴(kuò)增效率要求不高構(gòu)建目的基因與內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)于兩個絕對定量每次反應(yīng)都要作標(biāo)準(zhǔn)曲線,雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法,雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線處理與未處理樣品同時擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，獲得C

20、(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的絕對拷貝數(shù)用內(nèi)參基因?qū)δ康幕蚓换换蟮哪康幕蛑迪啾鹊贸鎏幚砼c未處理的樣本中目的基因的表達(dá)差異,39,實(shí)例分析,相對定量實(shí)例,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?比較病毒刺激細(xì)胞后，細(xì)胞抗病毒基因ISG54的表達(dá)情況差異。樣品：病毒刺激細(xì)胞，對照細(xì)胞試劑： TransZol Up、TransStart Top Green qPCR SuperMix、 TransScript

21、TM II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix其它材料： 內(nèi)參引物（GAPDH） 目的基因引物（ISG54）,對照樣品及內(nèi)參引物,確定對照樣本（Calibrator） 多個樣本比較情況下，其中之一作為對照樣本，其它所有樣本中目的基因的表達(dá)都相對于對照上調(diào)或下調(diào)。確定內(nèi)參基因 （GAPDH或β-actin ） 在所有樣本中恒定表達(dá)的已知基因，該內(nèi)參基因可以是一個或多個。內(nèi)參基

22、因一般是穩(wěn)定表達(dá)的，但在個別物種中可能并非穩(wěn)定表達(dá)，此時需選擇多個內(nèi)參引物。,數(shù)據(jù)分析,擴(kuò)增曲線,溶解曲線,GAPDH內(nèi)參基因,擴(kuò)增曲線,溶解曲線,ISG54目的基因,數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)分析,△△Ct = △Ct(實(shí)驗(yàn)) — △Ct(對照) △Ct(實(shí)驗(yàn)) = Ct（實(shí)驗(yàn)，目的基因） — Ct（實(shí)驗(yàn)，內(nèi)參基因） △Ct(對照) = Ct（對照，目的基因） — Ct（對照，內(nèi)參基因）2 －△△Ct =2 －（－3.22）= 9.32病

23、毒刺激細(xì)胞后，細(xì)胞中的ISG54抗病毒基因表達(dá)上調(diào)了9.32倍。,2 －△△Ct,如何制作標(biāo)準(zhǔn)品,以Adeasy腺病毒質(zhì)粒為例： 一個質(zhì)粒 MW= 36820 bp × 2 ×330 = 2.43 ×107 2.43 ×107 g/mol

24、 6.023 ×1023個分子/mol = 4.03 ×10-17 g,,一個質(zhì)粒(1 copy)的質(zhì)量 =,-計(jì)算出拷貝數(shù)（copies/ul）-梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品（大體積稀釋10 μ

25、l to 90 μl ）-定量PCR，檢查Ct值差異-產(chǎn)物跑膠鑒定大小,如何計(jì)算擴(kuò)增效率,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定引物擴(kuò)增效率,Y=-3.488 × logX+55.03R2=0.999E=93.5%,E=10(-1/slope) －1,利用TaqMan法研究ERBB2 在正?；蛉橄倌[瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異已知在50%的乳腺腫瘤樣本中，ERBB2表達(dá)異常，因此可以作為一個檢測標(biāo)準(zhǔn)選用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因FAM標(biāo)記的ER

26、BB2探針VIC標(biāo)記的GAPDH探針構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線雙重PCR反應(yīng)陰性對照無RNA對照（空白）無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（基因組）,實(shí)例分析-2,標(biāo)準(zhǔn)曲線,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 – FAM detection for ERBB2,樣品擴(kuò)增：正常vs腫瘤,,PMT1-FAM detection- ERBB2,PMT2-VIC detection- GAPDH,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,ERBB2

27、表達(dá),GAPDH表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果,HealthyRNA,TumorRNA,,GAPDH,ERBB2,10951052,21302492,9550085730,136000130800,Copies ng/ µl Total RNA,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.0172492

28、/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.011,0.018,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.182-ΔΔc(t) =1.51-1.93結(jié)果與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相近,53,,參照染料（ROX）,參照染料選擇,標(biāo)準(zhǔn)化熒光信號調(diào)整非PCR因素造成的誤差，如加樣誤差提供較穩(wěn)定的基線部分儀器在使用前會使用標(biāo)準(zhǔn)化熒光信號進(jìn)行校正參照染料的使用由儀器決定ABI a

29、nd Stratagene 使用ROXBio-Rad 使用標(biāo)準(zhǔn)化熒光信號Roche, Corbett, Cepheid 和 MJ Research不使用內(nèi)參染料,使用內(nèi)參染料使數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確,55,qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法 qRT-PCR,概述,核酸提取cDNA 合成(兩步法 qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)方法和原則,樣品準(zhǔn)備,必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),分析擴(kuò)增曲線、

30、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析,數(shù)據(jù)分析,56,,判斷數(shù)據(jù)有效性,,57,用擴(kuò)增曲線檢驗(yàn)qPCR體系用融解曲線檢驗(yàn)qPCR體系用標(biāo)準(zhǔn)曲線檢驗(yàn)qPCR體系用No-Template Control( NTC)檢驗(yàn)qPCR體系（引物）用No RT Control檢驗(yàn)qPCR體系（模板）,擴(kuò)增曲線,平滑起始無擴(kuò)增起峰時間正常NTC和NRC無擴(kuò)增 或擴(kuò)增起峰較晚,CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考,Ct值的可信范圍,臨

31、床檢驗(yàn)小于33科學(xué)研究小于38內(nèi)參基因小于20，樣品間差距不超過1復(fù)孔不超過0.5,CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考,60,溶解曲線分析,呈現(xiàn)單峰峰的寬度較小NTC和NRC均無較高的峰出現(xiàn),61,擴(kuò)增效率,r2=0.999 Slope= -3.364E=10(-1/slope) －1,r2: 0.95~1 Slope: -3.58~ -3.10E: 90%~110%,熒光定量PCR-- NTC,熒光

32、定量PCR-- NTC,,引物二聚體,No RT Control,RT反應(yīng)中的陰性對照，即不加入RT酶的反應(yīng)目的：檢測RNA中是否有基因組DNA的殘留將No RT Control產(chǎn)物與正常cDNA同時進(jìn)行qPCR觀察其結(jié)果，判斷正常cDNA的擴(kuò)增結(jié)果是否可信、該RNA是否可用,熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)參考范圍,66,,熒光定量PCR問題解析,67,擴(kuò)增曲線分析,基線設(shè)置是否正確基線校準(zhǔn)基線開始值(3-10) 基線終止值（

33、指數(shù)期之前）閾值設(shè)置是否正確設(shè)置在指數(shù)增長期(可自動或手動設(shè)置）,68,擴(kuò)增曲線分析,初始擴(kuò)增不規(guī)則主要由于模板中存在抑制物。樣品擴(kuò)增過早是由于初始模板濃度太高。,69,擴(kuò)增曲線分析,曲線不平滑,探針或熒光染料品質(zhì)不好儀器使用過度，熒光收集不穩(wěn)定儀器未經(jīng)過校正（包括自動校正或ROX校正)體系中抑制物較多，導(dǎo)致熒光不穩(wěn)定,擴(kuò)增曲線問題-精密度差,加樣誤差，體系配置錯誤，反應(yīng)液沒有混勻。低拷貝基因或模板濃度過高或過低。未引入

34、校正系統(tǒng)。,融解曲線分析,分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性: 單峰證明特異檢測 : - 基因組污染 (NTC出現(xiàn)與目的條帶相同的峰) - 非特異擴(kuò)增(不同的Tm) - 引物二聚體(NTC出現(xiàn)比目的基因Tm小的峰), …,72,標(biāo)準(zhǔn)曲線分析,可能的影響因素 1. 稀釋精度 2. 加樣精度 3. 反應(yīng)體系的優(yōu)化 4. 模板降解,