pcr分子診斷技術

1、PCR分子診斷技術,王洋 2016.12.27,,內(nèi)容,PCR技術的概念及發(fā)展簡史PCR反應的基本成分PCR基本原理和反應過程實時熒光定量PCR檢測基本原理和方法PCR技術的應用、臨床意義及發(fā)展趨向臨床PCR檢驗的實驗室管理,PCR技術的概念及發(fā)展簡史,PCR概念 PCR的由

2、來是Polymerase chain reaction的首個字母的組合，是聚合酶鏈式反應的簡稱，是一項體外擴增DNA序列的技術。PCR發(fā)展簡史 ?1985年美國科學家Kary Mullis在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學術論文，從此PCR技術得到了生命科學界的認同，并與1993年獲得了諾貝爾化學獎。

3、 1,,?1988年saiki 從水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱DNA聚合酶，此酶能耐高溫，在熱變性中不會失活，從而解決了PCR操作技術中酶鈍化為實際操作而帶來的困擾，極好的提高了PCR的擴增效率，從此，此酶被命名為 Taq DNA聚合酶。 ?自PCR方法不斷改進后，現(xiàn)PCR方法已衍生幾十種之多，目前實時熒光定量PCR方法已被臨床廣泛應用，不僅可以用于定

4、性檢測而且可以確定原始樣品含量。廣泛應用于遺傳學、微生物學乃至整個生命科學研究中，由于PCR方法有著極強的實用性，因此仍會被不斷完善，進一步在生命科學研究中發(fā)揮更好的作用。,PCR反應的基本成分,?模板 是待擴增序列的核酸，包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、mRNA和細胞等都可以作為PCR反應的模板。?特異性引物 是

5、與靶DNA 3’和 5’端特異性結(jié)合的寡核苷酸片段，是決定PCR特異性的關鍵。當每條引物都能特異性地與模板DNA中的靶序列復性形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，才能保證其特異性。?熱穩(wěn)定DNA聚合酶 是PCR技術實現(xiàn)自動化的關鍵，是從嗜熱古細菌中最早分離出的，最常用的DNA聚合酶。 2,?脫氧核甘三磷酸（dNTP） 標準PCR反

6、應體系中包含4種等物質(zhì)的量濃度的脫氧核甘三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。?二價陽離子 所有的熱穩(wěn)定DNA聚合酶都要求有游離的二價陽離子，常用的是Mg2＋，Mn2+ ?緩沖液 維持PCR反應體系中的PH，使用Tris－Cl緩沖液。?一價陽離子 標準的PCR緩沖液中包含50mmol／L的KCl，有益于DNA片段的擴增。,PCR的基本反應原理和特點,PCR原理

7、 PCR基本過程類似于DNA的天然復制，特異性依賴于靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。整個過程由變性－退火－延伸三個基本反應步驟構(gòu)成。 變性：模版DNA經(jīng)加熱至94℃左右，雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙股螺旋解鏈，變成兩條單鏈，為與引物結(jié)合做準備。 退火：DNA加熱變性成單鏈后，當溫度降至一定程

8、度（55℃左右）時，引物即與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。 延伸：在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP為原料，按A－T、C－G堿基配對與半保留復制原則，合成一條新的與模板DNA鏈互補的鏈。 3,重復上述變性－退火－延伸

9、的循環(huán)過程，每一循環(huán)獲得的“半保留半復制”鏈繼續(xù)成為下次循環(huán)的模板。通常一個完整的循環(huán)時間需要2-4min，2-3h就能將靶核酸放大幾百萬倍。 一般臨床擴增目的核酸將循環(huán)次數(shù)設定在40-50個循環(huán)之間，以此達到擴增目的。,PCR的特點?特異性高 包括：引物的特異性及延伸時，堿基配對的正確性；Taq DNA聚合酶的穩(wěn)定性。?靈敏度高 PCR擴增產(chǎn)物的量以指數(shù)方式增長，能在2-3h內(nèi)，將1個靶分子DNA擴增至10億個

10、分子，因此一個反應體系中如有2-3個靶分子，則可成功檢測出目的基因。?簡便快速 通過PCR技術可在2-4小時之內(nèi)獲得目的基因，為臨床患者提供快速準確的確診檢測。,實時熒光定量PCR法,概念 指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及信號強弱的變化來及時分析目的基因的拷貝數(shù)目，通過與已知量的標準品進行比較，實現(xiàn)實時定量的方法。反應過程 在實時熒光定量PCR反應過程中，對整個過程進行了實時

11、的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式“S”增加的，隨著反應循環(huán)數(shù)的增加，最終不再以指數(shù)方式生產(chǎn)模板，而進入“平臺期”。 4,實時熒光定量PCR法熒光閾值和循環(huán)閾值,熒光閾值（threshold） 概念：是在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定的一個熒光強

12、度標準，即PCR擴增產(chǎn)物量的標準。,,循環(huán)閾值（cycle threshold value，Ct） 概念：PCR擴增過程中擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的熒光閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。特點 操作簡便、快速、高效、較高的靈敏性及特異性、污染性低。,PCR技術的臨床應用、意義及發(fā)展趨向,PCR臨床應用?感染性疾病的診斷與治療 包括：病毒：肝炎病毒、HIV、HPV、流感病毒等 細菌

13、：結(jié)核桿菌、TP、UU、CT、NG等 寄生蟲：弓形蟲、瘧原蟲等?遺傳性疾病的診斷及預防 包括：染色體疾病、血紅蛋白病、血友病、遺傳性耳聾、糖尿病等 ?腫瘤標志物的監(jiān)測與診斷 包括：乳腺癌、腸癌、白血病等 ?個體化用藥的臨床指導 包括：藥物作用靶點相關基因、藥物代謝酶基因、藥物副作用相關基因等,PCR臨床意義：? 快速確診是否有病毒、細菌等致病性微生物感染；?了解體內(nèi)感染的數(shù)量、復

14、制程度，是否具有傳染性；?對臨床治療的用藥監(jiān)測，有無好轉(zhuǎn)或耐藥情況，如產(chǎn)生耐藥，如何指導用藥種類及計量等。PCR的發(fā)展趨勢 隨著臨床分子生物學的不斷發(fā)展，DNA測序技術已逐漸成熟，可為臨床疾病的分子診斷提供更精確的判定依據(jù)，現(xiàn)由一代測序技術已發(fā)展至三代測序技術，為醫(yī)療領域帶來更方便、快捷的檢測手段。,臨床PCR檢驗的實驗室管理,PCR實驗室的布局設計臨床PCR檢驗標本的采集、運送PCR核酸檢測的工作流程PCR污染的

15、產(chǎn)生及預防措施實時熒光PCR擴增儀簡介臨床PCR檢驗的質(zhì)量控制實驗室質(zhì)量管理體系的建立,PCR實驗室的布局設計,原則：各區(qū)獨立、注意風向、因地制宜、方便工作。區(qū)域劃分：試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。注意事項：1.每個區(qū)域應分開獨立，各區(qū)域設計緩沖間。不能將各區(qū)域的設施物品交叉使用，不易使用中央空調(diào)、注意傳遞窗的設置避免發(fā)生區(qū)域間空氣直通的現(xiàn)象。2.實驗室內(nèi)空氣在PCR實驗室專用走廊內(nèi)應按照試劑準備區(qū)－標本制備

16、區(qū)－擴增區(qū)－產(chǎn)物分析區(qū)單一方向流動，避免空氣反向流動，將PCR后區(qū)的擴增產(chǎn)物帶入前區(qū)的潔凈區(qū)域。3.各區(qū)域應配置專用的工作用品、紫外燈及儀器設備等物品。,臨床PCR檢驗標本的采集、運送,標本采集?采集時間（選擇最具有臨床感染特點的時間點，防止臨床出現(xiàn)假陰性結(jié)果）?標本類型和采集量（針對不同病原體的特性，選擇正確的標本類型及采集量）?采樣質(zhì)量的評價（指標本的質(zhì)量是否符合檢測要求，如血液標本有無溶血、脂血，分泌物標本有無采集到足夠的

17、脫落細胞等）?采樣容器的選擇（一般應選擇無菌密封的容器，血液標本需選擇含EDTA、枸櫞酸鹽抗凝劑的容器，防止肝素納抑制核酸物質(zhì)的提?。?標本運送及保存核酸為DNA的標本在室溫下建議8h內(nèi)送至實驗室檢測，2-8可保存3d；RNA的標本4h內(nèi)送至實驗室檢測，如不能及時檢測應立即分離血清－20℃存放（1-2周）。分泌物室溫下8h內(nèi)送檢，如不能及時檢測，應使用生理鹽水洗滌處理后保留沉淀于－80℃保存。檢測完畢的陽性標本應分離血清至－80℃冰

18、箱存放。,PCR核酸檢測的工作流程,試劑準備區(qū) 該區(qū)域為PCR室最潔凈區(qū)域，僅存放PCR備用試劑，在配制試劑前應從冰箱提前半小時取出，室溫解凍后使用。試劑應根據(jù)當日工作量酌情拿取或配制，避免反復凍融。配制及分裝過程中應在超凈工作臺內(nèi)完成，避免來回走動，手套應注意潔凈避免污染試劑。標本制備區(qū) 將待檢測離心后的標本放入生物安全柜或全自動核酸提取儀內(nèi)進行核酸的提取，標本制備期間應及時更換可能被污染的手套，避免交叉污染

19、。,擴增區(qū) 將提取好的核酸擴增反應物加蓋密封好后放置于相應的核酸擴增儀中，設置好該批實驗的模板后進行核酸擴增反應。在擴增結(jié)束后，運用儀器軟件分析出擴增產(chǎn)物的濃度值。產(chǎn)物分析區(qū) 此區(qū)域一般用于基因突變、分型檢測的反向點雜交實驗中，將核酸擴增產(chǎn)物加入已固定多種探針的硝酸纖維素膜或尼龍膜中，將樣本中與膜條上同源序列的探針結(jié)合，再經(jīng)顯色后得到基因序列。 以上兩個區(qū)域是PCR實驗室污染較為嚴重的區(qū)域，因此應

20、每次在實驗結(jié)束后應對儀器、操作臺等物品進行紫外燈照射及消毒液（10％的次氯酸鈉、75%的酒精）擦拭，以助于擴增產(chǎn)物的降解。,PCR污染的產(chǎn)生及預防措施,污染的來源：?標本間的交叉污染（標本收集時、容器密封不嚴溢灑、加樣時污染加樣器、標本中病毒可隨氣溶膠擴散等）?PCR試劑的污染（耗材、加樣器等）?擴增產(chǎn)物的污染（最常見的污染源）?氣溶膠的污染（最可能、嚴重的污染源）氣溶膠：由固體或液體小質(zhì)點分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散

21、體系，體積為1-100nm。是由空氣與液體表面摩擦形成，實驗操作中的劇烈震蕩反應管，污染加樣器的反復吸樣以及在室內(nèi)來回的走動等行為。據(jù)計算統(tǒng)計一個氣溶膠顆粒可含4.8×104個拷貝數(shù)。,污染的監(jiān)測與預防措施?加樣器：對污染的加樣器進行及時處理，并使用一次性含有濾芯的吸頭，同時對吸頭及反應管進行高壓滅菌后再行使用。?試劑的配制存放：嚴防試劑配制過程中產(chǎn)生的污染、配制好的試劑必須與標本、擴增產(chǎn)物分開存放。?操作手法：嚴格按照

22、PCR實驗操作要求及預防污染的原則進行核酸提取。?設立空白及陰、陽性對照：每批試驗。,實時熒光PCR擴增儀簡介,美國ABI公司在1996年推出實時熒光7700系列，于1997引入國內(nèi)，成為我國第一臺使用的擴增儀，隨后又研發(fā)出一系列的擴增儀，如5700、7000、7300、7500、7900等型號。1.儀器組成：ABI 7300擴增檢測系統(tǒng)（半導體PCR儀，鹵鎢燈光源、四色濾鏡輪和冷CCD照相機進行熒光檢測）及配套應用分析軟件、電腦。

23、2.檢測原理：采用精確的化學原理和復雜的多組分計算方法，準確地檢測和處理PCR指數(shù)級擴增的數(shù)據(jù)，得出高精度的Ct值。,3.特點：多色熒光檢測（FAM、SYBR Green I、VIC／JOE、TAMRA和ROX多種熒光染料）；實時數(shù)據(jù)監(jiān)控，并有熔點曲線實時分析；96個樣品孔采用鹵鎢燈作為光源，穩(wěn)定但壽命短。4.儀器使用的注意事項：放置水平、有穩(wěn)定的電壓并連接地線（配備UPS不間斷電源）、保證正常運行的室溫溫度不超過15-25，儀器要

24、放置在通風、散熱較好的區(qū)域，遠離水源、火源、有腐蝕性物質(zhì)及磁場感染等環(huán)境影響。,5.儀器的維護與保養(yǎng)：在日常實驗結(jié)束，儀器冷卻后對儀器表面進行正常維護及保養(yǎng)工作；使用中應小心熱蓋與反應槽的污染，并定期使用95%的乙醇進行擦拭，如被污染嚴重應先使用中性消毒液進行處理；每年應要求儀器廠家對儀器的光學部分、溫控部分、ROI及背景進行熒光強度的校正。,臨床PCR檢驗的質(zhì)量保證,檢驗的質(zhì)量控制是整個實驗室質(zhì)量體系運行的核心工作，只有對檢驗的每一個

25、環(huán)節(jié)進行嚴格把關，才能保證檢驗質(zhì)量準確有效。臨床PCR檢驗的質(zhì)量保證重點包括：試劑（標準品、質(zhì)控品等）及消耗品的質(zhì)檢；人員資質(zhì)的要求；儀器的校準及維護保養(yǎng)；實驗操作的規(guī)范性；實驗室日常工作的規(guī)章制度（實驗室及人員的生物安全和保護措施、清潔消毒）；質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)。,PCR實驗室質(zhì)量管理體系的建立,依據(jù)國內(nèi)《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和ISO15189認可：CNAS CL02《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可》的準則和美國CAP認證的

26、PCR分子實驗室要求等相關規(guī)定，建立標準、規(guī)范化的實驗室質(zhì)量管理體系內(nèi)容。體系結(jié)構(gòu)?質(zhì)量手冊：闡明實驗室的質(zhì)量方針、并描述質(zhì)量體系的文件，包括實驗室的質(zhì)量方針、目標、組織結(jié)構(gòu)及質(zhì)量體系要求等。?程序文件：對實驗室工作流程的文件化描述，包括目的、范圍、職責及具體工作流程等。,?作業(yè)指導書：實驗室日常工作的指導性文件，一般分為管理、儀器、項目三大類，內(nèi)容包括檢驗目的、原理、標本類型、操作步驟、參考區(qū)間、臨床可報告范圍及參考文獻等。?