pcr增效劑

1、【專題】【專題】PCRPCR添加劑簡介添加劑簡介1.3PCR添加劑研究概述PCR添加劑是PCR反應(yīng)中的一種增效劑，它們在PCR反應(yīng)中起到提高PCR反應(yīng)的特異性、增加PCR擴增的產(chǎn)量及防止無效擴增等有益效果。由于PCR技術(shù)在有些情況下擴增的不完美性，從PCR技術(shù)發(fā)明的初期開始，人們就展開了對PCR反應(yīng)中添加其它化學(xué)物質(zhì)的研究。迄今為止，在PCR添加劑的研究領(lǐng)域，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了越來越多的PCR添加劑，它們都以各自的特性在不同的方面對PCR反

2、應(yīng)起著促進(jìn)作用。而隨著PCR添加劑研究的不斷發(fā)展，在各種相關(guān)研究中，人們逐漸從研究和應(yīng)用單一型PCR添加劑轉(zhuǎn)向研究和應(yīng)用復(fù)合型PCR添加劑，從傳統(tǒng)PCR添加劑的研究開發(fā)轉(zhuǎn)向新材料新化合物PCR添加劑的研究開發(fā)。傳統(tǒng)的PCR添加劑包括常見的助溶劑、離子化和非離子化的除垢劑以及一些諸如氯化四甲基銨（TMAC）、甜菜堿、SSB（單鏈結(jié)合蛋白）等。多年來人們對這些添加劑的研究表明，它們在一定的濃度范圍內(nèi)對某些PCR有著增效作用，但在另外一些情況

3、下或在其它的濃度范圍內(nèi)對PCR反應(yīng)又有著抑制作用，所以這些PCR添加劑的在不同反應(yīng)體系中的應(yīng)用應(yīng)通過試驗來調(diào)整和合理選擇，合理準(zhǔn)確的使用會使PCR反應(yīng)獲得很大的改善，從而得到試驗所需要的理想結(jié)果。甜菜堿是一種高效的甲基受體，它在一些細(xì)菌體內(nèi)對抵抗因鹽份引起的滲透壓升高起著重要的作用，其做為一種PCR添加劑，出現(xiàn)在Rees.W.A.等人對甜菜堿降低DNA的Tm所做的研究之后。甜菜堿廣泛存在于多種酶以及PCR試劑盒中，它能提高PCR擴增的效

4、率和特異性，特別是在長PCR（LongPCR）擴增時常被應(yīng)用。Barnes指出，在Long－PCR中添加甜菜堿能夠使每個循環(huán)的熱變性溫度下降到92℃～93℃，且退火溫度也可以下降1℃～2℃，從而補償因退火條件變化及因其它添加劑引起的酶穩(wěn)定性下降引起的PCR反應(yīng)的負(fù)面效果。另外，他還指出甜菜堿不僅能促進(jìn)高GC含量片段的擴增，而且能提高普通的PCR擴增的目的產(chǎn)物量。甜菜堿另外一個優(yōu)點是，作為一種滲透保護(hù)劑，它具有和牛血清白蛋白（BSA）類似

5、的功能，能夠防止聚合酶的變性。把Long－PCRBuffer中的BSA換成甜菜堿將有利于減少彌散問題的發(fā)生。甜菜堿也有可以克服DNA少量污染帶來的擴增困難，這意味著PCR反應(yīng)可以在低質(zhì)量模板存在的情況下進(jìn)行。氯化四甲基銨（TMAC）最早被用于在雜交反應(yīng)中減少DNA／RNA的錯配以提高特異性，在PCR反應(yīng)中，它能夠增加PCR反應(yīng)的效率和提高PCR反應(yīng)的特異性。在TedHung等人首次發(fā)現(xiàn)TMAC提高PCR反應(yīng)特異性的研究中，他們選擇了兩個

6、mousecDNA的基因片段進(jìn)行擴增實驗。結(jié)果顯示，含有1105～1104MTMAC的實驗組擴增結(jié)果在電泳圖上只出現(xiàn)一條單一的目的條帶，而未含有TMAC的實驗組特異性非常差，有多條非目的條帶出現(xiàn)。EricChevet等人在研究中還發(fā)現(xiàn)，通過添加TMAC可以提高AT含量豐富的DNA片段的Tm，從而通過改善引物的特異性結(jié)合來提高PCR反應(yīng)的特異性。在研究中，他們實驗了不同濃度的TMAC促進(jìn)PCR反應(yīng)的效果，發(fā)現(xiàn)TMAC的最佳添加濃度為60m

7、M。他們的研究還表明，TMAC不僅可以提高PCR反應(yīng)的特異性，而且可以提高PCR反應(yīng)的效率，三對引物的擴增實驗均發(fā)現(xiàn)添加TMAC可以提高PCR目的產(chǎn)物產(chǎn)量5～10倍。板模型中，牛腦GTPcDNA（660bp58%GC）模板為主要受測模型，所有五種亞砜類化合物首先在這個模型上進(jìn)行測試。結(jié)果表明，除添加nbutylsulfoxide的實驗組未出現(xiàn)任何目的產(chǎn)物外，其它四種被測化合物均有表現(xiàn)出很強的提高PCR反應(yīng)特異性的效果，且對應(yīng)得到目的產(chǎn)物

8、均有很高的產(chǎn)量。具體效果效果為：tetramethylenesulfoxide為效果最佳，methylsecbutylsulfoxide次之，接下來是npropylsulfoxide，DMSO以其只能獲得所有產(chǎn)物中89％的特異性產(chǎn)物而居最后。在產(chǎn)量上，添加tetramethylenesulfoxide，methylsecbutylsulfoxide及npropylsulfoxide后的實驗組為添加DMSO實驗組的2～3倍多。而在接下的來

9、實驗中，對剩下四種化合物，同樣以牛腦GTPcDNA（660bp58%GC）模板為模型實驗了的各種化合物的有效作用濃度范圍，實驗結(jié)果表明，tetramethylenesulfoxide的有效作用濃度范圍為：0.28～1.0M，methylsecbutylsulfoxide的有效作用濃度范圍為：0.03～0.31M，npropylsulfoxide的有效作用濃度范圍為：0.15～0.36M，DMSO的有效作用濃度范圍為：0.75～1.25M

10、。在996bp人骨髓白細(xì)胞cjuncDNA(64%GC)模型上所做的進(jìn)一步測試表明，變性溫度為95℃時，tetramethylenesulfoxide相比于DMSO有較好的作用效果，而propylsulfoxide相比于DMSO則效果較差；變性溫度為92℃時，tetramethylenesulfoxide則為唯一有效的添加劑。而在511bp人PSMcDNA(52%GC158bp73%GC片段)模型上的測試再一次證明tetramethyl

11、enesulfoxide為最有效的添加劑，DMSO次之，propylsulfoxide居最后。和作者稍早前基于相同的出發(fā)點對系列砜類化合物作為PCR添加劑所做研究的結(jié)果對比分析可知，雖然methylsulfone比DMSO的效果稍好，但亞砜類化合物總體來說作用效果要好于砜類化合物。作者進(jìn)一步的比較分析指出，這種在PCR反應(yīng)中不同亞砜類化合物間所表現(xiàn)出的不同效果是有一定的化學(xué)式上的結(jié)構(gòu)依賴性的，同比來說環(huán)狀結(jié)構(gòu)的砜類、亞砜類及胺類化合物作

12、用效果明顯優(yōu)于其它結(jié)構(gòu)的化合物。有研究者認(rèn)為DMSO提高PCR反應(yīng)的特異性是由于其于模板DNA的大溝和小溝結(jié)合并破壞其雙鏈結(jié)構(gòu)，在這里，作者認(rèn)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)化合物的獨特作用效果可能是由于其破壞了模板DNA大溝和小溝里帶有供體和受體互補氫鍵的理想構(gòu)象，也有可能其通過限制DNA鏈的自由旋轉(zhuǎn)而使得DNA骨架的相鄰基團間位間排斥減小。新型高效是以上從結(jié)構(gòu)類似化合物中篩選新PCR添加劑的出發(fā)點，近年來，復(fù)合型PCR添加劑的開發(fā)更是朝這各目標(biāo)又邁進(jìn)了一

13、步。所謂的復(fù)合型添加劑就是把兩種或兩種以上的PCR添加劑通過一定的比例混合在一起形成的新型PCR添加劑，和單一PCR添加劑相比，其促進(jìn)PCR的效率更高。N.Baskaran等人的報道中，實驗了四種不同的片段的PCR，其中兩個高GC片段（64％和80％），兩個非高GC片段（44％和52％）。當(dāng)在同一個體系中同時擴增四個片段時，實驗表明1.0M的甜菜堿結(jié)合6％～8％DMSO及5％DMSO結(jié)合1.2～1.8M的甜菜堿能很好的同時擴增出四種目的

14、片段，雖然高濃度的DMSO及高濃度的甜菜堿在也能擴增出某種或某幾種片段，但四種目的片段的產(chǎn)量均衡性比不上甜菜堿和DMSO組成的復(fù)合型添加劑。最近，J.Kang等人在隨機序列DNA文庫的同步PCR擴增試驗中也同樣發(fā)現(xiàn)1M的甜菜堿結(jié)合5％DMSO能改善PCR擴增的效果。相比于以上兩種PCR添加劑組成的簡單復(fù)合型添加劑，M.Ralser等人及M.Musso等人則相繼報道了三種以上PCR添加劑組成的復(fù)合型添加劑。MarkusRalser等人對其

15、混合配置形成的含有甜菜堿，DMSO，DTT及BSA四種物質(zhì)的復(fù)合型添加劑在12對引物(GC含量61％～75％)擴增實驗中進(jìn)行了測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳的復(fù)合型添加劑配比如下（30ul體系中終濃度）：0.54M甜菜堿、1.34MDTT、1.34％DMSO及11ugmlBSA。在這一最佳配比下可以獲得最好的PCR擴增特異性和最高的PCR擴增產(chǎn)量。他們的實驗結(jié)果還表明，這種配比的PCR增效劑同比于Qiagen，Invitrogen及Bioline等