高級(jí)分子生物學(xué)試題及答案

1、注意注意:每人答案務(wù)必不能完全一樣每人答案務(wù)必不能完全一樣4試述酵母雙雜交系統(tǒng)的原理、構(gòu)建及基本用途。試述酵母雙雜交系統(tǒng)的原理、構(gòu)建及基本用途。(12(12分)第一種答：酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)?是一項(xiàng)專(zhuān)門(mén)用來(lái)研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，它首先由FieldsS和SongOK于1989年提出。這項(xiàng)新技術(shù)在驗(yàn)證已知蛋白質(zhì)之間的相互作用或篩選與特定靶蛋白呈特異性作用的候選蛋白的研究中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。其可行性和有效性已被證實(shí)，并

2、被推廣到了諸如信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、腫瘤基因表達(dá)等多個(gè)研究領(lǐng)域，受到越來(lái)越多的重視。酵母雙雜交系統(tǒng)的原理酵母雙雜交系統(tǒng)的原理?酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)使用蛋白質(zhì)的兩種具有特別功能的結(jié)構(gòu)域：一種是與DNA結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域（簡(jiǎn)稱(chēng)BD），另一種是激活DNA轉(zhuǎn)錄的激活結(jié)構(gòu)域（簡(jiǎn)稱(chēng)AD）。研究表明，這兩種結(jié)構(gòu)域并不需要一定在同一個(gè)蛋白質(zhì)上才起作用。事實(shí)上，一個(gè)含有BD的蛋白質(zhì)在與另一個(gè)含有AD的蛋白質(zhì)結(jié)合以后就可以激活轉(zhuǎn)錄，該原理構(gòu)成了酵母雙雜交技術(shù)

3、的基礎(chǔ)。?在雙雜交系統(tǒng)中，兩種融合蛋白被表達(dá)：一種是目標(biāo)蛋白—X，它有時(shí)被形象地稱(chēng)為誘餌蛋白。X在它的N端與BD融合在一起；另一種是潛在的能夠與X結(jié)合的目標(biāo)蛋白—Y。Y與AD融合在一起。如果X與Y相互作用，那么XY的結(jié)合就形成一種完整的活性轉(zhuǎn)錄激活物。如此形成的轉(zhuǎn)錄激活物能夠驅(qū)動(dòng)一個(gè)容易檢測(cè)的報(bào)告基因的表達(dá)。于是，報(bào)告基因的表達(dá)量可以用來(lái)作為測(cè)定X與Y相互作用的尺度。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立酵母雙雜交系統(tǒng)的建立1.選擇載體2.將“誘餌”蛋白

4、X的基因和目標(biāo)蛋白Y的基因分別插入到BD載體和AD載體之中，以形成BDX和ADY融合蛋白3.轉(zhuǎn)染：使用特定的手段將重組后的BDX載體和ADY載體轉(zhuǎn)染到特定的營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母宿主細(xì)胞；4.篩選：利用雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型的恢復(fù)篩選出同時(shí)含有BD載體和AD載體的細(xì)胞；5.活性檢測(cè)。應(yīng)用：1.發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能2.在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用3.篩選藥物作用位點(diǎn)及藥物對(duì)蛋白

5、相互作用影響篩選藥物作用位點(diǎn)及藥物對(duì)蛋白相互作用影響4.建立基因組蛋白建立基因組蛋白連鎖圖鎖圖特點(diǎn)與意義：（1）表達(dá)具有組織特異性和階段特異性。即：在不同組織中表達(dá)有不同類(lèi)型的miRNA在生物發(fā)育的不同階段里有不同的miRNA表達(dá)。（2）（2）miRNA具有高度保守性，即各種miRNA都能在其他種系中找到同源體。（2）（3）與靶mRNA3’UTR結(jié)合，序列特異性的在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的翻譯表達(dá)。一些偏大的miRNA(27nt)可能參與了

6、基因組的重組裝。（2）（4）miRNA獨(dú)有的特征：其5’端第一個(gè)堿基對(duì)U有強(qiáng)烈的傾向性，而對(duì)G卻有抗性，但第二到第四個(gè)堿基缺乏U，一般來(lái)講，除第四個(gè)堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。（2）（5）miRNA執(zhí)行一定的生物學(xué)功能：在生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、細(xì)胞的分化、增殖和凋亡以及腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮著重要作用。（2）1、RNARNA干擾的發(fā)現(xiàn)和原理干擾的發(fā)現(xiàn)和原理?RNA干擾是指通過(guò)雙鏈RNA使目的mRNA降解，從而特異性地

7、抑制目的蛋白表達(dá)的現(xiàn)象。RNA干擾是普遍存在于真菌、植物、果蠅等各類(lèi)真核生物之中的現(xiàn)象，類(lèi)似于一種古老的免疫機(jī)制。1990年，Napoli教授在研究矮牽?；ú闋柾驎r(shí)發(fā)現(xiàn)了基因共抑制現(xiàn)象（cosuppression）[1]。她在體外構(gòu)建了控制矮牽?；ɑㄉ幕虿闋柾蚱?，連上花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子，連入農(nóng)桿菌的TDNA質(zhì)粒，在矮牽牛花中過(guò)度表達(dá)。她原先預(yù)期，查爾酮的過(guò)度表達(dá)能加深牽?；ɑㄉ淖仙墙Y(jié)果卻導(dǎo)致了矮牽?；ㄗ哟?/p>

8、花色的褪色，內(nèi)源性的查爾酮遭到沉默。Napoli教授把這一現(xiàn)象稱(chēng)之為內(nèi)源性基因共抑制現(xiàn)象。1998年，rewJ.Hamilton教授研究了番茄ACC氧化酶基因的基因共抑制現(xiàn)象。他利用放射性標(biāo)記法和放線(xiàn)菌酮處理法分析轉(zhuǎn)錄后ACC氧化酶基因的mRNA和成熟mRNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源重組基因片段能成功轉(zhuǎn)錄，但是mRNA成功轉(zhuǎn)錄出后，因?yàn)槟撤N原因發(fā)生了轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranionalgenesilencingPTGS）[2]。因此，

9、rewJ.Hamilton認(rèn)為內(nèi)源性基因共抑制現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。1998年，F(xiàn)ire和Mello課題組接手了Guo教授研究的秀麗新小桿線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵基因par1[3]的課題。他們以秀麗新小桿線(xiàn)蟲(chóng)為模型，發(fā)現(xiàn)在Guo的課題中，引發(fā)線(xiàn)蟲(chóng)par1基因沉默的是小片段的雙鏈RNA[4]，而不是正義單鏈RNA或負(fù)義單鏈RNA。他們之后又研究了秀麗新小桿線(xiàn)蟲(chóng)的unc22基因，進(jìn)一步闡述了雙鏈RNA在基因沉默中的作用，并創(chuàng)造性地使