細(xì)胞因子生物學(xué)活性檢測

1、細(xì)胞因子生物學(xué)活性檢測細(xì)胞因子水平測定是細(xì)胞免疫功能檢測的一個重要組成部分。由于許多細(xì)胞因子cDNA克隆和表達(dá)的成功，給細(xì)胞因子單克隆抗體制備、生物學(xué)功能的鑒定提供必要條件。目前檢測細(xì)胞因子水平主要包括兩類方法：一是生物學(xué)活性的檢測，這類方法是利用細(xì)胞因子某一特定的生物學(xué)作用所設(shè)計的檢測方法，如IL2維持活化T細(xì)胞的增殖，IFN能保護(hù)病毒對正常細(xì)胞的感染，TNFα選擇性殺某些腫瘤細(xì)胞等，因此敏感性也較高；二是定量的檢測，常用酶聯(lián)免疫吸附

2、試驗(ELISA)，如多克隆抗體與單克隆抗體，識別不同表位兩種單克隆抗體的雙抗體夾心法，生物學(xué)和定量的檢測方法各有優(yōu)缺點，在必要時可同時進(jìn)行檢測。一、白細(xì)胞介素1(IK1)生物學(xué)活性測定白細(xì)胞介素1是一種重要的細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，IL1不僅對多種免疫活性細(xì)胞有重要的調(diào)節(jié)功能，而且與發(fā)熱、炎癥發(fā)生以及某些疾病的病理變化有關(guān)。目前對IL1產(chǎn)生水平的檢測主要應(yīng)用生物學(xué)活性檢測的方法。ConA刺激小鼠胸腺細(xì)胞檢測IL1生物學(xué)活性(

3、一)原理小鼠胸腺細(xì)胞在絲裂原刺激下表達(dá)IL1受體，在有IL1同時存在的條件下，IL1可協(xié)同絲裂原促T細(xì)胞的增殖作用。根據(jù)加入IL1后增殖水平(３HTdR摻入率)的增加可計算出樣品中IL1的活性單位，或計算出刺激指數(shù)。(二)操作步驟取6～8周齡C57BL16小鼠，拉頸處死，無菌取胸腺置不銹鋼網(wǎng)篩上，用注射器針蕊研磨成細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.510７／ml↓細(xì)胞懸液內(nèi)加入ConA，使終濃度為3μg／ml，在96孔培養(yǎng)板中加100μl(1.5

4、10６細(xì)胞)↓加入不同稀釋度待測樣品和IL1標(biāo)準(zhǔn)品100μl／孔(ConA終濃度為1.5μg／ml)↓37℃CO２孵箱66h每孔加３HTdR0.5μci↓37℃CO孵箱6h多頭細(xì)胞收集儀收獲于9999型玻璃纖維紙上↓烤干，移入液閃瓶中，加適量閃爍液，于液閃儀上測β計數(shù)計算:1.從IL1標(biāo)準(zhǔn)曲線上測得IL1的活性單位2.也可用刺激指數(shù)(SI)表示加入96孔板中，兩種細(xì)胞各加50μl孔↓加入不同稀釋度的IL1或待測樣品，同時設(shè)EL４和CT

5、LL2細(xì)胞對照↓置5％CO２37℃培養(yǎng)24～28小時后加入３HTdR0.5μci50μl孔繼續(xù)培養(yǎng)6～8小時↓收集樣品，β計數(shù)㈢試劑和器材1.EL４細(xì)胞2.CTLL2細(xì)胞3.標(biāo)準(zhǔn)rIL1。4.３HTdR、POPOP、PPO、二甲苯。5.玻璃纖維濾紙，細(xì)胞收集儀。6.β計數(shù)儀7.96孔板，無菌吸管，滴管、試管及加樣器頭。8.FCSRPMI1640CO２培養(yǎng)箱等。㈣注意事項：1.在一步法檢測IL1時，其EL４細(xì)胞濃度不宜超過110４孔，血清

6、終濃度應(yīng)＜5％。2.在二步法檢測IL1時，其EL４細(xì)胞濃度在210５孔時，犉d轉(zhuǎn)移上清稀釋度不宜低于1∶8其誘導(dǎo)時間應(yīng)12～24小時間為佳。誘導(dǎo)血清濃度應(yīng)≤1％。3.在檢測經(jīng)誘導(dǎo)的上清中IL1時，應(yīng)避免使用A23187，TPA和ConA等較強(qiáng)的能誘導(dǎo)EL４細(xì)胞產(chǎn)生IL2的誘導(dǎo)劑來刺激IL1的產(chǎn)生。二、白細(xì)胞介素2(IL2)的生物學(xué)活性測定(一)原理IL2主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，又為T細(xì)胞增殖所必需，故稱T細(xì)胞生長因子（TCellGrowt

7、hfactTCGF）。IL2產(chǎn)生的水平反映T細(xì)胞的功能，牪僅是免疫調(diào)節(jié)重要的研究對象，而且與臨床多種疾病密切相關(guān)，CTLL是C57BL／6來源的。犘!鼠殺傷性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞系，由Gills1977年建立，只有在IL2存在的培養(yǎng)基中才能生長。因此可作為指示細(xì)胞來測定待檢樣品中IL2的水平。除CTLL外，絲裂原活化的T淋巴母細(xì)胞亦可作為檢測IL2活性的指示細(xì)胞。(二)方法可根據(jù)實驗室條件，選用３HTdR摻入法和MTT法1.３HTdR摻入法I