高效液相色譜的進(jìn)樣器和色譜

1、高效液相色譜的進(jìn)樣器和色譜進(jìn)樣器進(jìn)樣器早期使用隔膜和停流進(jìn)們器，裝在色譜色譜柱入口處。現(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLCfj樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。1.隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門(mén)設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價(jià)格便宜，操作方

2、便。但不能在高壓下使用(如10MPA以上)此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1～2%加之能碉各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析分析使用受到限制。2.停流進(jìn)樣?？杀苊庠诟邏合逻M(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)“鬼峰”另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。3.閥進(jìn)樣。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥(以美國(guó)RHEODYNE公司的7725和7725I型最常見(jiàn)

3、)，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊子(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積在存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣(約下降5～10%左右)，但耐高壓(35～40MPA)，進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好(0.5%)，操作方便。(jy“9d3|s3J(OZ六通閥進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%(最多75%)，并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)

4、生由進(jìn)樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5～10倍9最少3倍)，這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)和流動(dòng)相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)：①樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45UM濾膜過(guò)濾，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過(guò)泵的最大壓力轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過(guò)高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣呂殘留在進(jìn)樣閥中，每次分

5、析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。G6~Q5|B[4Es3Q4.自動(dòng)進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。:s3f$~s%S7L!m三、色譜柱三、色譜柱8F%gA%]6z色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料好多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球(包括離子交換樹(shù)脂

6、)、多孔碳等，其粒度一般為3，5，7，10UM等，柱效理論值可達(dá)5～16萬(wàn)米。對(duì)于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效對(duì)于同系物分析，只要500即可對(duì)于較難的分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá)2萬(wàn)的柱子，因此一般10～30CM左右的柱長(zhǎng)就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。7^2O0`C%U“hd3t$_柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，不要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱

7、中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍料徑的厚度。在一般的液相色譜液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。1.柱的構(gòu)造柱的構(gòu)造反之亦然.③一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去柱關(guān)的雜質(zhì).否則反沖會(huì)迅速降低柱效.④選擇使用適宜的流動(dòng)相(尤其是PH)，以避免固定相被破

8、壞.有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和“，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解.⑤避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物生物樣品直接注入柱骨需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱.保護(hù)柱一般是填有固定相的短柱.保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換.⑥經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)，在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)