02-基因工程制藥

1、第二章 基因工程技術(shù)制藥,,2024/3/22,1,一、概 述---幾個(gè)概念,,基因工程技術(shù)？,是將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。,2024/3/22,2,,基因工程藥物？,系指先確定對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白質(zhì)合成過程的基因分離、純化或進(jìn)行人工合成，利用重組DNA技術(shù)加以改造，最后將該基因放入可以大量生產(chǎn)

2、的受體細(xì)胞中不斷繁殖，并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)，通過這種方法生產(chǎn)的新型藥物。,一、概 述---幾個(gè)概念,2024/3/22,3,,基因工程藥物上游階段？,主要是分離目的基因、構(gòu)建工程菌（細(xì)胞）目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達(dá)。選擇基因表達(dá)主要考慮的是保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達(dá)的量和分離純化的難易。此階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。,一、概 述---幾個(gè)概念,2024/3/22,4,,基因工程藥物下

3、游階段？,從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。此階段是將實(shí)驗(yàn)室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等。,一、概 述---幾個(gè)概念,5,,制備基因工程藥物的一般程序,一、概 述,獲得目的基因,,組建重組質(zhì)粒,,構(gòu)建基因工程菌（或細(xì)菌）,,培養(yǎng)工程菌,,

4、除菌過濾,,半成品檢定,,包裝,6,,傳統(tǒng)制藥存在的問題,許多在疾病診斷、預(yù)防和治療中有重要價(jià)值的內(nèi)源性活性物質(zhì)（如激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)多肽、調(diào)節(jié)蛋白、酶類等人體活性多肽）以及某些疫苗，由于材料來源困難或者制造技術(shù)問題而無法研制出產(chǎn)品而付諸應(yīng)用。 從動(dòng)物臟器中提取出來（比如動(dòng)物腦垂體中的一些肽類激素，包括腎上腺皮質(zhì)激素、催產(chǎn)素起引產(chǎn)或催產(chǎn)作用，胃腸道類激素緩激肽等），也因造價(jià)太高，或來源困難而供不應(yīng)求。,一、概 述,7,,傳統(tǒng)制藥存在

5、的問題,由于免抗原等緣故（由于酶的相對(duì)分子量較大，對(duì)人體可能具有抗原性，因此動(dòng)物酶如作為注射用藥要經(jīng)過大量的藥理實(shí)驗(yàn)），使他們?cè)谑褂蒙鲜艿较拗?。在提取過程中難免有病毒感染，因此還可能會(huì)對(duì)病人造成嚴(yán)重后果。,一、概 述,2024/3/22,8,,基因工程技術(shù)的特點(diǎn),就是能夠十分方便有效地生產(chǎn)許多以往難以大量獲取的生物活性物質(zhì)，甚至可以創(chuàng)造出自然界中不存在的全新物質(zhì)。它能從極端復(fù)雜的機(jī)體細(xì)胞內(nèi)取出所需要的基因，將其在體外進(jìn)行剪切拼接

6、、重新組合，然后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞進(jìn)行表達(dá)，從而生產(chǎn)出比原來多數(shù)百、數(shù)千倍的相應(yīng)的蛋白質(zhì)。,一、概 述,2024/3/22,9,,基因工程技術(shù)的特點(diǎn),可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性多肽和蛋白質(zhì)，為臨床使用提供有效的保障；可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處，可以通過

7、基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造； 利用基因工程技術(shù)可以獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源,一、概 述,10,,二、目的基因的獲得,從染色體中直接分離純化目的基因極為困難。 原核細(xì)胞不能直接克隆真核基因。,來源于真核細(xì)胞的產(chǎn)生基因工程藥物的目的基因，是不能進(jìn)行直接分離的，原因有二：,2024/3/22,11,,二、目的基因的獲得,Ⅰ 逆轉(zhuǎn)錄法,目的克隆真核基因常用的方法有逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法：,DNA序列不含內(nèi)含子,2024/3/22,

8、12,,二、目的基因的獲得,1 mRNA的純化,利用mRNA的3’末端含有polyA的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dt）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度洗脫時(shí)，或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫下來，經(jīng)過兩次寡聚（dt）纖維素柱后，可得到較高純度的mRNA。,2024/3/22,13,,二、目的基因的獲得,2 cDNA第一鏈的合成,一般mRNA都帶有3‘-poly A，所以可用寡聚d

9、T作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。一次好的逆轉(zhuǎn)錄可使寡聚dT選出的mRNA有5%~30%被拷貝。,2024/3/22,14,,二、目的基因的獲得,3 cDNA第二鏈的合成,先用堿解或RHase酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。雙鏈cDNA分子的大小常用變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測(cè)定。,2024/3/22,15,,二、目的基因的獲得,4 cDNA克隆,用于cDNA的

10、克隆載體有兩類：質(zhì)粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌體DNA（如λgt10、λgt10）等。根據(jù)重組后插入的cDNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白，又將載體分為表達(dá)型載體和非表達(dá)型載體。在DNA克隆操作中應(yīng)根據(jù)不同的需要選擇適當(dāng)?shù)妮d體。,16,,二、目的基因的獲得,5 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞,體外包裝的重組體感染受態(tài)宿主細(xì)胞。,2024/3/22,17,,二、目的基因的獲得,6 cDNA文庫的鑒定,cDNA文庫是指細(xì)胞中全

11、部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總各。根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑顏色改變法。然后采取凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析法等方法進(jìn)行進(jìn)一步篩選和鑒定。,2024/3/22,18,,二、目的基因的獲得,7 目的cDNA克隆的分離和鑒定,從cDNA文庫分離特異性cDNA克隆，主要采用下列兩種方法：1 核酸探針雜交法；2 免疫反應(yīng)鑒定法。,19,,二、目的基因的獲得,Ⅱ反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法,1

12、985年聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）創(chuàng)立后，人們將它與反轉(zhuǎn)錄方法結(jié)合起來得到一種新的合成cDNA的方法，即反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法。 該方法是mRNA經(jīng)反應(yīng)轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，不需要再合成cDNA第二鏈，而是在特異引物協(xié)助下，用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，特異性地合成目的cDNA鏈，用于重組、克隆。,20,,二、目的基因的獲得,Ⅲ 化學(xué)法,目的克隆真核基因常用的方法有逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法：,較小的蛋白質(zhì)和多肽的編碼基因可以用人工化

13、學(xué)合成法獲得,合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火連接成較長(zhǎng)的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。,21,,二、目的基因的獲得,,人工化學(xué)合成基因的限制：A 不能合成太長(zhǎng)的基因。最長(zhǎng)50-60bp。只適用于克隆小分子肽的基因。B 人工合成基因時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并會(huì)為選擇密碼子帶來困難，如用氨基酸順序推測(cè)核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與

14、天然基因不完全一致，易造成中性突變。C 費(fèi)用太高。,2024/3/22,22,,三、目的基因的表達(dá),基因表達(dá) 是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程?；蚋咝П磉_(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下一個(gè)外源基因片段，拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。,23,,三、目的基因的表達(dá),基因表達(dá)研究的主要問題： 基因表達(dá)產(chǎn)量 表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

15、 產(chǎn)物的生物學(xué)活性 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,2024/3/22,24,,三、目的基因的表達(dá),① 容易獲得較高濃度的細(xì)胞；② 能利用易得廉價(jià)原料③ 不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素④ 發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)⑤ 容易進(jìn)行代謝調(diào)控⑥ 容易進(jìn)行DNA技術(shù)操作⑦ 產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，且易提取純化。,一、宿主細(xì)胞的選擇,2024/3/22,25,,三、目的基因的表達(dá),原核細(xì)胞真核細(xì)胞,一、宿主細(xì)胞的選

16、擇,,大腸桿菌枯草芽孢桿菌鏈霉菌,,酵母絲狀真菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞,2024/3/22,26,外源基因在大腸桿菌中的表達(dá),,2024/3/22,27,外源基因在大腸桿菌中的表達(dá),,表達(dá)載體必須具備的條件,1. 載體能夠獨(dú)立的復(fù)制2. 具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記。且克 隆位點(diǎn)應(yīng)在啟動(dòng)子序列后，以使克隆的外源基 因得以表達(dá)3. 具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA聚合 酶所識(shí)別4. 具有很強(qiáng)的阻

17、遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有 當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,2024/3/22,28,外源基因在大腸桿菌中的表達(dá),,表達(dá)載體必須具備的條件,5. 具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力 量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄無關(guān)的基因 同時(shí)很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定6. 所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即 起始密碼AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻 譯。,2024/3/22,29,外源基

18、因在大腸桿菌中的表達(dá),,大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征,大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)：,全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物,2024/3/22,30,外源基因在大腸桿菌中的表達(dá),,大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征,大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)：,表達(dá)不存在信號(hào)肽，故產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物， 提取困難 缺乏對(duì)真

19、核生物蛋白的復(fù)性功能 缺乏對(duì)真核生物蛋白的修飾加工系統(tǒng) 易引起免疫反應(yīng) 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素,2024/3/22,31,外源基因在大腸桿菌中的表達(dá),,大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征,大腸桿菌作為外源基因的表達(dá)宿主，遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，因此備受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛、最成功的高效表達(dá)體系，并常常作為高效表達(dá)研究的首選體系。,2024/3/22,32,外源基

20、因在大腸桿菌中的表達(dá),,外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理,啟動(dòng)子,終止子,,轉(zhuǎn)錄,核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)粒拷貝數(shù),,翻譯,2024/3/22,33,外源基因在大腸桿菌中的表達(dá),,啟動(dòng)子,2024/3/22,34,外源基因在大腸桿菌中的表達(dá),,啟動(dòng)子,Lac 表達(dá)系統(tǒng),以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理,具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因排列次序?yàn)椋?啟動(dòng)子（lacP）-操縱基因（lacO）-結(jié)

21、構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA） 正調(diào)節(jié)因子CAP 負(fù)調(diào)節(jié)因子lac1,2024/3/22,35,Lac 表達(dá)系統(tǒng),正調(diào)節(jié)因子CAP,cAMP激活CAP，CAP-cAMP復(fù)合物與lac操縱子上專一位點(diǎn)結(jié)合后，能促進(jìn)RNA聚合酶與-35、-10序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄?；蚬こ讨惺褂玫膌ac啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即Plac UV5,,2024/3/22,36,Lac 表達(dá)系統(tǒng),Lac UV5 突變體

22、,Plac UV5 突變體能夠在沒有CAP存在的情形下非常有效地起始轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受lac1 的調(diào)控，因此用它構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時(shí)比野生型Plac更易操作。,,2024/3/22,37,Lac 表達(dá)系統(tǒng),負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac1,在無誘導(dǎo)情形下，lac1基因產(chǎn)物形成四具體阻遏蛋白，與啟動(dòng)子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。,,2024/3/22,38,Tac 表達(dá)系統(tǒng),tac 啟動(dòng)子是由trp的-35 序

23、列和lacUV5的-10 序列拼接 而成的雜合啟動(dòng)子,調(diào)控模式與lacUV5相似，但mRNA 轉(zhuǎn)錄水平更高于trp 和lacUV5啟動(dòng)子（P tac = 3 P trp = 11P lac），因此在要求 較高基因表達(dá)水平的情況下，選用tac 啟動(dòng)子比用lacUV5 啟動(dòng)子更優(yōu)越。,,2024/3/22,39,Lac、tac啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求,在普通大腸桿菌中，Lac1阻遏蛋白僅能滿足細(xì)胞染色

24、 體上lac操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要。,當(dāng)多拷貝的的lacO隨著帶有 lacUV5、tac啟動(dòng)子的表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌后，Lacl阻遏蛋白與lacO的比例 顯著下降，無法保證每一個(gè)lacO都能獲得足夠的Lacl阻 遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。表現(xiàn)為在無誘導(dǎo)物存在的情形下 ，lacUV5、tac 啟動(dòng)子有較高的本地轉(zhuǎn)錄。,,2024/3/22,40,Lac、tac啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求,為了使以Lac

25、、Tac表達(dá)具有嚴(yán)緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的 能力，一種能產(chǎn)生過量的Lacl 阻遏蛋白的lacl 基因突變 體laclq被應(yīng)用于表達(dá)系統(tǒng)。 大腸桿菌JM109等菌株的基因型均為lacq，常被選用為 Lac、Tac表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌。 但是這些菌株也只能對(duì)低拷貝的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊調(diào) 控，在使用高拷貝復(fù)制子的構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，仍能觀 察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄。 需在表達(dá)載體中插入lacq基

26、因以保證有較多的Lacl阻遏 蛋白產(chǎn)生。,,2024/3/22,41,Lac、tac表達(dá)系統(tǒng)存在的問題,IPTG 用于誘導(dǎo)lac、tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但由于IPTG本身具有一定的毒性。從安全角度，對(duì)表達(dá)和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。,一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG,解決方法,lac 和tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控 乳糖替代IPTG誘導(dǎo)lac 和tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,,2024/3/2

27、2,42,Lac、tac表達(dá)系統(tǒng)存在的問題,Lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控,把阻遏蛋白Lacl的溫度敏感突變體lacl(ts)、lacq(ts)插入表達(dá)載體或 整合到染色體后，均能使lac 和 tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受到溫度嚴(yán)緊調(diào)控 在較低溫度（30℃）時(shí)抑制，在較高溫度（42 ℃ ）時(shí)開放。,用乳糖替代IPTG誘導(dǎo) lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,乳糖在β-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導(dǎo)劑

28、的作 用這一過程涉及乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和和轉(zhuǎn)化，其效率受到多種因素的影 響和制約，因此乳糖誘導(dǎo)的有效劑量大大高于IPTG。 乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存 在也會(huì)導(dǎo)致菌體生理及生長(zhǎng)特性變化。乳糖替代IPTG作為誘導(dǎo)劑 的研究要與發(fā)酵工藝結(jié)合起來，才能顯示其良好的前景。,,2024/3/22,43,外源基因在大腸桿菌中的表達(dá),,啟動(dòng)子,Trp 表達(dá)系統(tǒng),以大腸桿菌 trp 操縱

29、子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理,色氨酸啟動(dòng)子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄 呈基底狀態(tài)。 在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 變可有效地解除阻遏作用。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因 工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp 介導(dǎo)的目的基因表達(dá)。,2024/3/22,44,Trp 表達(dá)系統(tǒng),,2024/3/22,45,外源基因在大腸

30、桿菌中的表達(dá),,啟動(dòng)子,PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng),以λ噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL、PR為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)在野生型 λ 噬菌體中，PL、PR啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄與否決定了λ 噬菌體進(jìn)入了裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。,2024/3/22,46,PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng),轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理,由λ噬菌體PE啟動(dòng)子控制的cl基因的產(chǎn)物是PL、PR啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的阻遏物 。cl 基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子之間的錯(cuò)綜復(fù)雜的平衡關(guān)

31、系。由于通過細(xì)胞因子來控制 cl 基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。因此PL、PR表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體cl 857 (ts)的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 在較低溫度下（30℃）時(shí)以活性形式存在 在較高溫度（42℃ ）時(shí)失活脫落,,2024/3/22,47,PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng),宿主菌中沒有cl基因產(chǎn)物，PL、PR啟動(dòng)子的高強(qiáng)度直接轉(zhuǎn)錄，帶有PL或PR啟動(dòng)子的表達(dá)載體在普通大腸桿菌中相當(dāng)不穩(wěn)定,對(duì)宿

32、主菌的要求,用溶源化λ噬菌體的大腸桿菌作PL、PR啟動(dòng)子表達(dá)載體 的宿主菌N4830-1，POP2136等菌株已經(jīng)溶源化cl 857(ts) λ噬菌體，可用作表達(dá)外源基因時(shí)的宿主菌。 把 cl 857 (ts) 基因組裝在表達(dá)載體上 宿主菌選擇范圍更大,,2024/3/22,48,PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng)存在的問題,由于PL和PR表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)時(shí)不加化學(xué)誘導(dǎo)劑，成本又低廉，最初幾個(gè)在大腸桿菌中制

33、備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用PL或PR表達(dá)系統(tǒng)。,缺陷,在熱脈沖誘導(dǎo)中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達(dá)也會(huì)被激 活，其中一些是蛋白質(zhì)水解酶，有可能降解所表達(dá)的重 組蛋白。 在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時(shí)，通過熱平衡交換方式把培養(yǎng) 溫度提高到42℃需要較長(zhǎng)的時(shí)間，這種緩慢的升溫方式影 響誘導(dǎo)效果，對(duì)重組蛋白表達(dá)量有一定的影響。,,2024/3/22,49,T7表達(dá)系統(tǒng),大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)

34、錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為T7表達(dá)系統(tǒng)。,,2024/3/22,50,T7表達(dá)系統(tǒng),T7噬菌體基因1編碼的T7 RNA聚合酶選擇性激活 T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿 菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸 桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。 在細(xì)胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌體啟動(dòng)子的情形 下，大腸桿菌

35、宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過T7噬菌體轉(zhuǎn) 錄體系，最終T7噬菌體啟動(dòng)子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很 高的水平。,,2024/3/22,51,T7表達(dá)系統(tǒng),轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理,T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7 RNA聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。,化學(xué)誘導(dǎo)型溫度誘導(dǎo)型雙質(zhì)粒系統(tǒng),,2024/3/22,52,T7表達(dá)系統(tǒng),轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理,化學(xué)誘導(dǎo)型,噬菌體DE3 是λ噬菌體的衍生株，

36、一段含有l(wèi)acl、lacUV5啟動(dòng)子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int 基因中用噬菌體DE3作為表達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于Lac表達(dá)系統(tǒng)。,,2024/3/22,53,T7表達(dá)系統(tǒng),轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理,溫度誘導(dǎo)型,PL啟動(dòng)子控制 T7 RNA 聚合酶基因，通過熱誘導(dǎo)方式激發(fā)T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄酶降到很低的水平，尤其適用于表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋

37、白質(zhì)。,,2024/3/22,54,T7表達(dá)系統(tǒng)存在的問題,T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的，但也不可避免出現(xiàn)在相對(duì)較高的本底轉(zhuǎn)錄，如果目的基因產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌宿主有毒性，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。,解決辦法之一,因?yàn)門7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上肽聚糖外，還 能與T7 RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。 目前T7 溶菌酶基因都通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，它能 明顯降低本底轉(zhuǎn)錄，但對(duì)誘導(dǎo)后目的的

38、基因的表達(dá)水平無 明顯影響。,,2024/3/22,55,其他表達(dá)系統(tǒng),營養(yǎng)調(diào)控型,采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因phoA啟動(dòng)子或甘油3‘- 磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)ugp啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。 這兩個(gè)啟動(dòng)子受在培養(yǎng)基中的無機(jī)磷（Pi）濃度調(diào)控 （Pi﹥ 5mmol/L 時(shí)抑制，Pi﹤1mmol/L 時(shí)激活），具有 較高的轉(zhuǎn)錄水平。,,2024/3/22,56,其他表達(dá)系統(tǒng),糖原調(diào)控型,采用的有大腸桿菌半乳糖轉(zhuǎn)移系

39、統(tǒng)（mg1BAEC）mgl啟動(dòng) 或沙門氏菌阿拉伯糖基因araB啟動(dòng)構(gòu)建表達(dá)載體。 這兩個(gè)啟動(dòng)子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的 誘導(dǎo)物。其調(diào)控機(jī)理類似于Lac表達(dá)系統(tǒng)。,,2024/3/22,57,其他表達(dá)系統(tǒng),pH調(diào)控型,采用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因cadA 啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載 體。 cadA啟動(dòng)子受培養(yǎng)基中H+濃度，即pH值調(diào)控。（在 pH﹥8時(shí)抑制，pH﹤6時(shí)激活，pH = 6 時(shí)

40、轉(zhuǎn)錄活力最高）。 該表達(dá)系統(tǒng)要求菌體發(fā)酵溫度控制在27~30℃之間才能使 目的基因得到穩(wěn)定的表達(dá)。,,2024/3/22,58,其他表達(dá)系統(tǒng),溶氧調(diào)控型,采用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 啟動(dòng)子，硝基還 原酶基因nirB啟動(dòng)子或透明顫菌血紅蛋白基因 vgb 啟動(dòng)子 構(gòu)建表達(dá)載體。這些啟動(dòng)子中都含有對(duì)氧響應(yīng)的調(diào)節(jié)因子 fnr的作用位點(diǎn)。 在富氧條件下轉(zhuǎn)錄被抑制，在貧氧或微生物條件下轉(zhuǎn)錄被

41、 激活。,,2024/3/22,59,其他表達(dá)系統(tǒng),溶氧調(diào)控型,大腸桿菌 GJ100 有透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）啟動(dòng)子 控制下的T7 RNA 聚合酶基因表達(dá)質(zhì)粒，vgb 基因的轉(zhuǎn)錄 是受環(huán)境溶氧濃度調(diào)控的，在貧氧條件下vgb 基因的啟動(dòng) 子被激活。 因此，用大腸桿菌GJ100作為宿主時(shí)，表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控方式 為貧氧誘導(dǎo)型，菌體發(fā)酵時(shí)的溶氧濃度可以通過控制攪拌 轉(zhuǎn)速和通氣量加以

42、調(diào)節(jié)，與其他調(diào)控模式相比更適合于產(chǎn) 業(yè)化生產(chǎn)過程。,,2024/3/22,60,其他表達(dá)系統(tǒng),生物素調(diào)控型,用大腸桿菌生物素操縱子及其調(diào)控區(qū)構(gòu)建表達(dá)載體，而菌 體生長(zhǎng)過程中生物素會(huì)不斷消耗，當(dāng)濃度到達(dá)2ng/ml以下 時(shí)啟動(dòng)子被激活。 能夠在沒有外界的物理，化學(xué)信號(hào)的介入條件下自動(dòng)誘導(dǎo) 表達(dá)目的基因時(shí)這類表達(dá)載體的特點(diǎn)，其缺陷是不容易精 確控制自動(dòng)誘導(dǎo)的時(shí)刻。,,61,終止子,強(qiáng)化轉(zhuǎn)

43、錄終止的必要性,外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物，過長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增 加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降。 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域， 如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等

44、，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可 能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。 過長(zhǎng)的mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程無謂的能量 消耗。 更為嚴(yán)重的是，過長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而 大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。,,2024/3/22,62,終止子,強(qiáng)終止子的選擇與使用,目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌 rRNA操縱子上的rrn

45、T1T2以及T7噬菌體DNA上的TΦ。,對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w 終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用。,,2024/3/22,63,核糖體結(jié)合位點(diǎn),核糖體結(jié)合位點(diǎn),外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。 大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。

46、 mRNA 翻譯的起始效率主要由其5’端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）,,2024/3/22,64,2024/3/22,65,核糖體結(jié)合位點(diǎn),核糖體結(jié)合位點(diǎn),大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列5‘UAAGG AGG 3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，他通過識(shí)別大腸桿 菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3’端區(qū)域3‘AUU

47、CCUCC 5’ 并與之專一性結(jié)合將mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻 譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀 框架的起始位點(diǎn)，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯 起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列,,2024/3/22,66,核糖體結(jié)合位點(diǎn),核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響,SD序列的影響,一般來說m

48、RNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD（UAAGGAGG）序列與16S rRNA 的堿基互補(bǔ)性，其中以GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。對(duì)多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基序列尤為重要。對(duì)多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成C或T，均會(huì)導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低。,,2024/3/22,67,核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響,SD序列與起始密碼子之間的序列影響,SD序列下游堿基若為AAAA或UU

49、UU，翻譯效力最高； 而CCCC或GGGG 的翻譯效率則分別最高值的50%和25%。 緊鄰AUG的前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響。 對(duì)于大腸桿菌β-半乳糖苷酶的mRNA 而言，在這個(gè)位置 上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或 AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低20倍。,,核糖體結(jié)合位點(diǎn),2024/3/22,68,核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響,SD序列與起始密碼子之間的距離的影

50、響,SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA 在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖 體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。 在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處， 在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均導(dǎo)致翻譯起始 效率不同程度的降低。,,核糖體結(jié)合位點(diǎn),2024/3/22,69,核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響,起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影

51、響,大腸桿菌中的起始tRNA 分子可以同時(shí)識(shí)別AUG、GUG 和UUG三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常 GUG為AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。 除此之外，從AUG開始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān) 重要，至少這一序列不能與mRNA 的5‘端非編碼區(qū)形成 莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確 定位。 目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，

52、 均含有與啟動(dòng)子來源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列 和間隔是最佳的。,,核糖體結(jié)合位點(diǎn),2024/3/22,70,密碼子,生物體對(duì)密碼子的偏愛性,不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：,生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體ΦX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，

53、第三位上含有G或C的簡(jiǎn)并密碼子占90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì),,2024/3/22,71,密碼子偏愛性對(duì)外源基因表達(dá)的影響,由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程度的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。,一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)： 外源基因全合成 同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因,,密碼子,2

54、024/3/22,72,質(zhì)?？截悢?shù),質(zhì)粒拷貝數(shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響,目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)菌中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降。解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道,,2

55、024/3/22,73,外源基因在大腸桿菌中的表達(dá),,蛋白質(zhì)的合成是在細(xì)胞之中進(jìn)行的,目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)是：,表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡(jiǎn)單； 能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，一般可以達(dá)到占細(xì)胞 總蛋白的20%~40%。,目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有兩種：,在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)為不溶性的包涵體顆粒 包涵體存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 可溶性的蛋白質(zhì)除可存在于細(xì)胞質(zhì)中外，還可借助于本身 的功能

56、序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸體系，最終分泌 到周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)液中。,2024/3/22,74,外源基因在大腸桿菌中的表達(dá),,大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略,包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)寡聚型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)蛋白酶抗性或缺陷性表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建,2024/3/22,75,包涵體性異源蛋白的表達(dá),包涵體及其性質(zhì),在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致

57、密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB） 富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長(zhǎng)在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。 由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸工程桿菌大量合成非天然的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。

58、 除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白質(zhì)分子,,2024/3/22,76,以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn),包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有

59、致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白,,包涵體性異源蛋白的表達(dá),2024/3/22,77,以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn),包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn) 以包涵形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變性復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。 經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，有時(shí)甚至完全得不到有活性的蛋白

60、，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%,,包涵體性異源蛋白的表達(dá),2024/3/22,78,包涵體的變性與復(fù)性操作,包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵。在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)興途徑中。,,能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括：清 洗 劑 SDS、正十二醇肌氨酸、廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化促 溶 劑 鹽酸

61、胍，尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā) 形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極 端 pH 廉價(jià)、但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng),包涵體性異源蛋白的表達(dá),2024/3/22,79,包涵體的變性與復(fù)性操作,包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）,,,包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù) 將多肽鏈中被拆開的

62、游離巰基重新折疊 通過次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性,包涵體性異源蛋白的表達(dá),2024/3/22,80,,,這是因?yàn)榇竽c桿菌細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢(shì)不利于蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。一些需要通過二硫鍵的形成來維持其構(gòu)象的目標(biāo)蛋白在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中往往不能正確折疊。 解決這一問題的途徑之一是用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因trxB缺陷株作為宿主菌表達(dá)目標(biāo)蛋白

63、。研究表明trxB缺陷株細(xì)胞質(zhì)中能夠形成二硫鍵。這一菌株對(duì)于表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)而言是一個(gè)相當(dāng)重要的工具。,包涵體性異源蛋白的表達(dá),2024/3/22,81,分泌型異源蛋白的表達(dá),在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì),,,目標(biāo)蛋白以可溶性蛋白質(zhì)形式表達(dá)雖然可以避免包涵體復(fù)性帶來的問題，但是也有一定的缺陷，主要表現(xiàn)為大腸桿菌本身存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)往往只含有少量的，甚至沒有半胱氨酸殘基。富含半胱氨酸殘基，需要形成二硫鍵的蛋白質(zhì)大部分

64、被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的其他部位。,2024/3/22,82,在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì),,,在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)需要起始密碼，通常為編碼甲硫氨酸的 ATG。 ⑴ 在多數(shù)情況下，N端附加的甲硫氨酸對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒有特別的影響，但是也有附加的甲硫氨酸嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)生物活力的報(bào)道。 ⑵ 另外，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì)。從制備用于醫(yī)療目的的蛋白質(zhì)

65、的角度來看，這是一個(gè)需要引起重視的問題。,2024/3/22,83,,,去除附加的甲硫氨酸有兩種方法：,⑴ 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)甲硫氨酸氨肽酶基因。⑵ 在分離純化后在體外用外肽酶處理。但它們都對(duì)與甲硫氨酸相鄰的氨基酸殘基類型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。,2024/3/22,84,目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá),,,與純化包涵體相比，細(xì)胞質(zhì)中以可溶性形式表達(dá)蛋白質(zhì)的分離純化過程比較復(fù)雜，一般要通過親合層析才能達(dá)到比

66、較高的純度。 目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標(biāo)蛋白。 金黃色葡萄糖球菌蛋白G、A和衍生物7，日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，大腸桿菌麥芽糠結(jié)合蛋白，His-tag等是目前常用的與目標(biāo)基因融合表達(dá)的序列。,2024/3/22,85,目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá),,,目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)的優(yōu)點(diǎn),大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的

67、數(shù)量約為100種，只占 菌體總蛋白數(shù)量的4%。蛋白質(zhì)水解酶的含量與在細(xì)胞中 相比也少得多，因此目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)有利于分 離純化和減少蛋白水解酶的降解。目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間過程中信號(hào)肽被加工切 除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。周質(zhì)空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢(shì)使目標(biāo)蛋白能夠較好 折疊，維持正確的構(gòu)象。,2024/3/22,86,目標(biāo)蛋白外泌表達(dá),,,把所表達(dá)的

68、目標(biāo)蛋白外泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中可以進(jìn)一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。 目前成功的例子主要是采用以下方案： 與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達(dá) 與一些能提高細(xì)胞外膜通透性的因子融合或共表達(dá) 改變培養(yǎng)基的成分 歸納現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示這些方法僅對(duì)外泌分子量較小的蛋白質(zhì)有效，而且外泌效率一般都比較低。,2024/3/22,87,高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù),,,表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì)共表達(dá)