紅平紅球菌復(fù)蘇促進(jìn)因子基因克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、細(xì)菌活的非可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)是細(xì)菌在不良環(huán)境下形成的一種休眠方式。在所在環(huán)境改善時(shí)非可培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇為可培養(yǎng)狀態(tài)，但有關(guān)細(xì)菌復(fù)蘇機(jī)制并不明確。藤黃微球菌（Micrococcus luteus）細(xì)胞復(fù)蘇促進(jìn)因子（Resuscitation promoting factor,Rpf）首次被報(bào)道能促使休眠菌狀態(tài)細(xì)胞復(fù)蘇，并刺激正常細(xì)胞生長(zhǎng)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇促進(jìn)因子（Rpf）廣泛存在于高G+C含量革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，與細(xì)菌生長(zhǎng)及抵御不良環(huán)境有關(guān)。不

2、同種類細(xì)菌的Rpf種類和數(shù)量有一定差異。紅球菌屬的細(xì)菌廣泛分布于巖石、土壤、地下水等自然環(huán)境。多數(shù)種類在修復(fù)石油污染土壤、污水處理等方面有有廣闊應(yīng)用前景。紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）KB1分離自石油污染土壤，具有高效石油降解能力和環(huán)境適應(yīng)性。為探索Rpf在紅平紅球菌適應(yīng)環(huán)境中的作用，本文進(jìn)行了紅平紅球菌KB1 Rpf基因克隆、基因結(jié)構(gòu)分析、表達(dá)及生物學(xué)性質(zhì)研究，具體內(nèi)容如下：
　　設(shè)計(jì)了復(fù)蘇促進(jìn)因

3、子基因特異引物，從紅平紅球菌KB1基因組DNA擴(kuò)增出4種rpf基因，分別為564、1125、1128和555bp，編碼187、353、375和184個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。序列分析發(fā)現(xiàn)4種rpf基因分別與藤黃微球菌rpf基因，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）rpfB、rpfC及鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）rpfB有較高相似性。4個(gè)rpf基因編碼的蛋白都有一個(gè)類似藤黃微球菌細(xì)胞

4、復(fù)蘇促進(jìn)因子的Rpf域，含有1個(gè)保守谷氨酸殘基，由大約70個(gè)氨基酸組成。其中Rpf-1與結(jié)核分枝桿菌、鏈霉菌RpfC相似，只含1個(gè)Rpf結(jié)構(gòu)域，Rpf-2與結(jié)核分枝桿菌RpfB相似，含有1個(gè)Rpf域、1個(gè)G5域和2個(gè)DUF348，Rpf-3與鏈霉菌RpfB相似，含有1個(gè)Rpf域、G5域和3個(gè)DUF348，Rpf-4與藤黃微球菌Rpf相似，含1個(gè)Rpf域和1個(gè)LysM域。Rpf-2、Rpf-3含信號(hào)肽序列，Rpf-1、Rpf-4不含信號(hào)肽

5、。Rpf-1、Rpf-2、Rpf-3和Rpf-4均為親水性蛋白，含有多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點(diǎn)，沒有組氨酸位點(diǎn)。
　　設(shè)計(jì)特異表達(dá)引物，將紅平紅球菌KB1 rpf-1基因克隆于原核表達(dá)載體pET-32a(+)，在大腸桿菌BL21中高效表達(dá)，用Ni瓊脂糖親和層析柱純化重組蛋白，SDS-PAGE電泳分析表明純化蛋白分子量為36kDa。用人工合成底物4-Methylumbelliferyl-β-D-N-N’-N’-triacetyl

6、 chitotriose檢測(cè)發(fā)現(xiàn)rpf-1具有溶菌酶活性。溶菌酶比活力為2.07U/mg。以偶氮酪蛋白為底物測(cè)定了純化蛋白rpf-1的蛋白酶活性，發(fā)現(xiàn)純化蛋白能水解偶氮酪蛋白，蛋白水解酶比活力為235U/mg。
　　將純化的重組蛋白R(shí)pf-1添加到不同狀態(tài)紅平紅球菌細(xì)胞培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)正常生長(zhǎng)、VBNC狀態(tài)及-80℃低溫保存的細(xì)胞具有明顯復(fù)蘇或促生長(zhǎng)作用。添加10%的Rpf-1使低溫保存紅平紅球菌生長(zhǎng)速度增長(zhǎng)4.8-6倍。添加R