豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1、NSP2和NSP4免疫抑制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)可以引起妊娠母豬的繁殖障礙（后期流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱胎）及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾?。ㄩg質(zhì)性肺炎），PRRSV感染可導(dǎo)致豬體免疫抑制。國外體外試驗(yàn)證明，PRRSV NSP1、NSP2、NSP4和NSP11能抑制IFN-β啟動子活性，從而在體外能抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，但體內(nèi)試驗(yàn)尚未報道。本研

2、究將PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1、NSP2和NSP4進(jìn)行克隆鑒定，設(shè)計構(gòu)建分別表達(dá)NSP1、NSP2和NSP4的重組腺病毒，小鼠免疫試驗(yàn)證明NSP1具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，并通過體外PAM細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和豬體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫試驗(yàn)證實(shí)NSP1具有免疫抑制作用。主要研究內(nèi)容分為以下4個部分:
　　 1、PRRSV NSP1、NSP2(1-484)和NSP4原核表達(dá)與抗體制備將PRRSV SY0608株非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1、NSP2(1-

3、484)和NSP4基因克隆于pGEX-6P-1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21用0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果分析NSP1、NSP2(1-484)和NSP4基因獲得高量表達(dá)，大小分別約為69 kDa、77 kDa和48 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符，表達(dá)產(chǎn)物以融合蛋白包涵體形式存在。Westernblotting結(jié)果表明，融合表達(dá)的GST-NSP1、GST-NSP2(1-484)、GST-NSP4蛋白能與PRRSV感染豬血

4、清發(fā)生特異性反應(yīng)，證明其抗原性良好。經(jīng)包涵體洗夜裂解后得到純化蛋白GST-NSP1、GST-NSP2(1-484)和GST-NSP4，分別免疫ICR小鼠，獲得多克隆抗體。間接免疫熒光試驗(yàn)證明，該抗體能與PRRSV SY0608毒株產(chǎn)生特異性反應(yīng)，從而為非結(jié)構(gòu)蛋白特性研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、PRRSV NSP1、NSP2和NSP4重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定利用RT-PCR擴(kuò)增出高致病性PRRSV SY0608株的NSP1、NSP2

5、和NSP4基因，構(gòu)建穿梭載體pShuttle-CMV-NSP1、pShuttle-CMV-NSP2和pShuttle-CMV-NSP4，經(jīng)PCR和基因測序鑒定正確。Pme(I)線性化后在BJ5183大腸桿菌內(nèi)與腺病毒骨架載體pAdEasy-1同源重組，得到重組腺病毒陽性質(zhì)粒。重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac(I)線性化后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)包裝成完整的腺病毒，IFA和westernblotting結(jié)果表明，NSP1、NSP2

6、和NSP4重組腺病毒可以正確地表達(dá)目的蛋白。
　　 3、PRRSV NSP1、NSP2和NSP4重組腺病毒小鼠免疫抑制研究高致病性PRRSV是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)重要病原之一，但其致病機(jī)制尚不十分清楚。本試驗(yàn)在構(gòu)建3株重組腺病毒的基礎(chǔ)上，對其免疫特性在小鼠模型上進(jìn)行了研究。75只ICR小鼠隨機(jī)分為5組，每組15只。第1、2組分別注射DMEM和wtAd（野生型腺病毒）作為對照組，第3-5組分別背部皮下免疫重組腺病毒rAd-NSP1、

7、rAd-NSP2和rAd-NSP4，間隔二周用同樣方法加強(qiáng)免疫一次。免疫后不同時間取脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)，進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，并用ELISA檢測淋巴細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-10，結(jié)果為，與wtAd或DMEM對照組相比，rAd-NSP1、rAd-NSP2和rAd-NSP4組T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(SI)和IFN-γ顯著降低，IL-10明顯增高(P＜0.05)，但以rAd-NSP1組降低或升高幅度最大，證明高致病性PRRSVNSP1蛋白具

8、有較強(qiáng)的免疫抑制作用。
　　 4、PRRSV NSP1對豬體免疫抑制作用為了研究高致病性PRRSV NSP1蛋白的免疫作用，本研究將高致病性PRRSVNSP1重組腺病毒(rAd-NSP1)接種體外培養(yǎng)的豬肺泡細(xì)胞（PAM），用實(shí)時熒光定量PCR和ELISA方法分別檢測PAM細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-10水平，結(jié)果為rAd-NSP1接種PAM細(xì)胞72h后可顯著降低細(xì)胞上清中IFN-γ的水平，而IL-10的含量顯著提高。將rAd-