RNA干擾沉默PID1基因在C2C12細(xì)胞中表達(dá)的研究.pdf

1、隨著人們生活水平的不斷提高，消費(fèi)者和生產(chǎn)者越來(lái)越重視豬肉的品質(zhì)。衡量豬肉品質(zhì)的一個(gè)重要的指標(biāo)是肌內(nèi)脂肪(IMF)的含量，它對(duì)肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味有明顯的正效應(yīng)，目前關(guān)于調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪沉積的機(jī)理還不清楚，主效基因還沒(méi)有確定。PID1基因在脂肪細(xì)胞增殖中起重要作用，在肥胖人群中呈高豐度表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室研究了PID1基因在萊蕪豬、魯萊黑豬、大白豬三個(gè)豬種的背膘、背最長(zhǎng)肌和肝臟中的表達(dá)差異以及與IMF的關(guān)系，提示PID1基因可能與IMF的沉積密

2、切相關(guān)。本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠模型的方式，構(gòu)建以U6啟動(dòng)子控制下能產(chǎn)生針對(duì)PID1的短發(fā)夾環(huán)狀小干擾RNA表達(dá)載體，將干擾載體轉(zhuǎn)染進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞中，采用RT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)shRNA干擾載體對(duì)C2C12細(xì)胞中PID1mRNA和蛋白表達(dá)的下調(diào)作用，為進(jìn)一步研究驗(yàn)證PID1基因影響IMF沉積的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 為了構(gòu)建和篩選對(duì)小鼠PID1(phosphotyrosineinteractiondomain

3、containing1，PID1)基因RNA干擾的PID1-shRNA表達(dá)載體。根據(jù)小鼠PID1cDNA序列，優(yōu)化設(shè)計(jì)4條shRNA序列以及1條陰性干擾序列，相應(yīng)的雙鏈DNA被插入pGPU6/GFP/Neo載體中，即pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-D和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC。將

4、干擾載體轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，采用RT-PCR和Westernblot檢測(cè)shRNA對(duì)C2C12細(xì)胞PID1mRNA和蛋白表達(dá)的下調(diào)作用。結(jié)果表明：靶向PID1基因的4個(gè)shRNA重組質(zhì)粒載體經(jīng)測(cè)序分析，shRNA編碼序列與設(shè)計(jì)的片段完全一致，經(jīng)酶切凝膠電泳證實(shí)載體構(gòu)建成功。構(gòu)建的4個(gè)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，24h后細(xì)胞中PID1基因mRNA表達(dá)水平依次下調(diào)(23.58±1.87)％、(75.44±0.77)％、(70.52±0.