金麗假交替單胞菌JG1抑菌機理研究.pdf

1、假交替單胞菌（Pseudoalteromonas）廣泛分布于世界各地的海洋環(huán)境中，可分為產色素或不產色素兩大類，其中產色素菌株的顯著特征是能夠形成具有多種不同生物活性的代謝產物，如抗細菌、抗真菌、溶藻等活性。目前已從該屬菌株中分離純化出多種具有抑菌活性的小分子化合物、蛋白質、多糖等物質，而對該屬菌株基因組的分析也已成為研究其多種生物活性物質產生機制及對不同海洋環(huán)境適應性的重要手段。因此，對該屬菌株抑菌機理的研究有助于開發(fā)新型的有益菌制劑

2、和海洋藥物，從而廣泛應用于水產養(yǎng)殖病害、生物污損及赤潮等的防治中。本論文分離純化了金麗假交替單胞菌（Pseudoalteromonas flavipulchra）JG1所產生的多種抑菌物質并對其抑菌機理進行了初步探討，完成了該菌株的全基因組測序及分析，并對其適應復雜的海洋環(huán)境并形成生存優(yōu)勢的能力進行了闡釋，為后續(xù)對該菌株及其代謝產物的開發(fā)利用奠定了理論基礎。
　　金麗假交替單胞菌JG1分離自健康大菱鲆養(yǎng)殖海水，對多個種屬的菌株具有

3、較強的抑菌活性，如弧菌屬、芽孢桿菌屬等。通過石油醚﹑乙酸乙酯﹑正丁醇對JG1發(fā)酵液上清和菌體樣品進行分步萃取，發(fā)現(xiàn)菌株JG1發(fā)酵液的石油醚層、乙酸乙酯層萃取樣品及水層樣品均具有抑菌活性。這表明JG1的抑菌物質中既含有某些小分子物質如脂類、糖類、色素類化合物，也包含有大分子蛋白類物質，這兩類物質協(xié)同作用產生更好的抑菌效果。
　　采用硫酸銨沉淀法、SDS-PAGE及電洗脫法對JG1的胞外蛋白進行了分離純化，在SDS-PAGE中可見單一

4、條帶，且膠內活性檢測表明該蛋白對鰻弧菌有較強的抑菌活性。將此抑菌蛋白經De novo測序得到的兩條肽段的氨基酸序列與菌株JG1的蛋白質組序列進行比對，獲得其基因及氨基酸序列全長，并將其命名為PfaP。PfaP蛋白共由694個氨基酸組成，理論分子量為77.0 kDa，理論等電點為4.63，Signal P預測其不含有信號肽序列。氨基酸序列比對結果顯示，PfaP蛋白與被囊假交替單胞菌（P. tunicata）D2的L-賴氨酸氧化酶AlpP具

5、有58％的一致性，與地中海海洋單胞菌（Marinomonas mediterranea）MMB-1的抗微生物蛋白marinocine具有54%的一致性。由此推測PfaP蛋白為一種L-氨基酸氧化酶，其抑菌活性是由過氧化氫介導的，過氧化氫酶能夠抑制其抑菌活性的產生。
　　對PfaP蛋白的基因序列進行克隆，并分別與表達載體pET24a(+)、pET26b(+)、pET32a(+)、pBAD/Myc-HisB及pRSFDuet-1連接，構

6、建了重組表達菌株Escherichia coli BL21/pET24a(+)/PfaP、E. coli BL21/pET26b(+)/PfaP、E. coli BL21/pET32a(+)/PfaP、E. coli BL21/pBAD/Myc-HisB/PfaP以及 E. coli BL21/pRSFDuet-1/PfaP，并在體外誘導表達。PfaP蛋白能夠在大腸桿菌中得到異源表達，但可能由于在大腸桿菌中無法對該蛋白進行正確的翻譯后修

7、飾，其異源表達產物不能夠形成有活性的成熟蛋白。
　　菌株 JG1的乙酸乙酯萃取物經多步硅膠柱層析及半制備反相高效液相色譜分析，共分離得到5種具有抑菌活性的單體小分子化合物，分別為對羥基苯甲酸（1）、反式桂皮酸（2）、6-溴吲哚-3-乙酸（3）、N-羥基苯并異惡唑酮（4）和2'-脫氧腺苷（5）。其中，僅帶有一個溴原子的化合物3為黃褐色，稀釋后呈鮮艷黃色，推測其為菌株 JG1形成的一種色素分子，使菌落呈現(xiàn)金黃色。這5種小分子化合物對鰻

8、弧菌均具有抑菌活性，微量稀釋法檢測最小抑菌濃度分別為1.25、1.25、0.25、0.25和5 mg/ml?；衔?的抑菌活性最強，抑菌范圍也最廣，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑菌活性。由此可見，色素分子與抑菌蛋白的協(xié)同作用使菌株 JG1表現(xiàn)出良好的抑菌活性。這5種小分子化合物均首次發(fā)現(xiàn)能對海水養(yǎng)殖病原菌產生抑制活性。
　　采用Illumina高通量測序技術對JG1的全基因組進行了測序及分析，共預測得到4913個基因，總長度為4,

9、828,917bp，占基因組的87.71%。同時，在JG1基因組中發(fā)現(xiàn)預測的104個tRNA編碼基因和4個rRNA操縱子。與已知基因組序列的被囊假交替單胞菌（P. tunicata）D2、游海假交替單胞菌（P.haloplanktis） TAC125、大西洋假交替單胞菌（P. atlantica）T6c、2株假交替單胞菌TW-7和SM9913的COG注釋基因分布比較顯示，菌株JG1中參與次級代謝產物生物合成、轉運和分解，氨基酸轉運和代謝

10、以及翻譯、核糖體結構與起源的相關基因的豐度均為最高，與其能合成豐富的代謝產物的特征相一致。JG1中參與防御機制的基因豐度也較高，表明其具有良好的環(huán)境適應能力。
　　通過對JG1基因組的分析，發(fā)現(xiàn)了參與合成5種抑菌小分子化合物的相關基因，并預測了這些小分子化合物在JG1中的代謝途徑，而抑菌蛋白PfaP也參與了抑菌小分子物質6-溴吲哚-3-乙酸的生物合成過程，進一步表明JG1中的各種抑菌機制是緊密聯(lián)系的。在JG1的基因組中還發(fā)現(xiàn)有大量