φC31-att介導的家蠶-細胞轉基因及基于GAL4-UAS雙元系統(tǒng)控制蛹期發(fā)育.pdf

1、φC31的位點專一性重組系統(tǒng)能夠有效地介導噬菌體attB位點和宿主attP位點之間的整合，本研究利用該系統(tǒng)構建轉基因家蠶細胞和轉基因家蠶。研究構建了pSK-attB/Pie1-EGFP/Zeo-PASV40供體質(zhì)粒，其中φC31 attB位點下游具OpNPV的ie-1啟動子驅(qū)動gfp-zeocin融合基因的表達盒；同時構建了一個包含φC31整合酶基因瞬時表達盒的輔助質(zhì)粒pSK-Pie1/NLS-Int/NSL，其中兩側均帶有核定位信號序

2、列的φC31整合酶基因由BmNPV的ie-1啟動子驅(qū)動。在共轉染供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的家蠶培養(yǎng)細胞中可檢測到gfp-zeocin融合基因的表達，反向PCR產(chǎn)物測序結果顯示，φC31整合酶可以準確地識別和切割供體質(zhì)粒上的attB位點，并介導attB位點和細胞內(nèi)源性假attP位點之間的重組。同樣，將供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒通過精子介導法轉入家蠶的卵中，通過綠色熒光篩選，結合gfp基因的PCR鑒定獲得轉基因家蠶，插入位點的傍側序列分析結果顯示，基于φ

3、C31的位點專一性重組系統(tǒng)可以將外源基因?qū)爰倚Q基因組。研究結果為家蠶遺傳操作提供了新的途徑和策略。
　　延長家蠶的蛹期有可能實現(xiàn)繅絲工藝的重大改革。為了通過GAL4/UAS雙元系統(tǒng)在F1代蛹期特異性表達蛻皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖轉移酶基因（egt），明顯延緩蛹期發(fā)育，構建了效應系統(tǒng)載體piggyA3GFP-ie-neo-UAS-egt-polyA,（其中，egt基因由UAS控制表達）和激活系統(tǒng)載體piggyA3GFP-ie-neo

4、-BmWCP4-Gal4-polyA（其中，gal4的表達由BmWCP4啟動子控制）；兩種載體均帶有A3啟動子控制的gfp和BmNPV ie-1啟動子控制的neo。本實驗室的前期研究已通過 piggyA3GFP-ie-neo-BmWCP4-Gal4-polyA介導，將BmWCP4-Gal4表達元件導入家蠶實用品種菁松，并篩選鑒定至G7代，此基礎上，本研究進一步篩選、鑒定培育至G9代，獲菁松BmWCP4-Gal4系統(tǒng)；通過精子介導法將pi