水稻GAL4-UAS異位表達(dá)系統(tǒng)的建立和花模式形成基因SFL的功能分析.pdf

1、把轉(zhuǎn)基因的表達(dá)限制在特定的時(shí)空區(qū)域不僅是研究者們操縱轉(zhuǎn)基因的主要目標(biāo)之一，也是更為精確可靠地揭示基因功能的研究思路。GAL4/UAS雙因子異位表達(dá)技術(shù)體系就是控制基因在特定時(shí)空特異表達(dá)技術(shù)的一種并用于揭示基因的潛在功能。該系統(tǒng)由兩類(lèi)轉(zhuǎn)基因株系構(gòu)成，一類(lèi)是模式系(或稱(chēng)作驅(qū)動(dòng)系)，它是由增強(qiáng)子誘捕載體轉(zhuǎn)化植物所得，這類(lèi)株系的報(bào)告基因時(shí)空表達(dá)模式代表了驅(qū)動(dòng)蛋白GAL4-VP16(轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá)模式，故篩選報(bào)告基因時(shí)空特異表達(dá)的株系為限制轉(zhuǎn)基

2、因的時(shí)空性表達(dá)提供必備條件。另一類(lèi)是目標(biāo)系(或稱(chēng)效應(yīng)系)，它是由目標(biāo)載體攜帶目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化與模式系有相同遺傳背景的植物而來(lái)，目標(biāo)基因就是需要時(shí)空限制表達(dá)的基因，由只對(duì)GAL4-VP16起響應(yīng)的啟動(dòng)子UAS所控制，因而在沒(méi)有GAL4-VP16蛋白存在時(shí)，目標(biāo)系中的目標(biāo)基因是沉默的。而在模式系與目標(biāo)系的雜種后代中，目標(biāo)基因被組織特異性的GAL4-VP16所驅(qū)動(dòng)而呈現(xiàn)組織特異表達(dá)。本研究主要內(nèi)容是在水稻中建立GAIA/UAs雙因子異位表達(dá)技術(shù)平

3、臺(tái)并利用該技術(shù)重點(diǎn)鑒定一些轉(zhuǎn)錄因子基因的功能。主要結(jié)果如下： 1．用增強(qiáng)子誘捕載體pSMR-J18R轉(zhuǎn)化水稻品種中花11，在潮霉素抗性愈傷階段，篩選GUS不表達(dá)的愈傷，并分化為成熟單株，篩選表型正常的株系，鑒定整個(gè)生育期GuS報(bào)告基因的表達(dá)模式，篩選到5個(gè)組織特異性表達(dá)(P1，花藥；P2，柱頭；P3，花藥；P4，內(nèi)外稃；P6，葉片和雄蕊)和一個(gè)組成型表達(dá)的模式系(P7，在所有檢測(cè)的組織中表達(dá))。 2．構(gòu)建通用目標(biāo)載體pG

4、OFS1和pGOC17。其中，目標(biāo)載體pGOC17可以利用同源重組方法高效裝載外源基因。 3．在pGOFS1載體基礎(chǔ)上，構(gòu)建目標(biāo)基因載體23個(gè)，其中轉(zhuǎn)錄因子載體20個(gè)，非轉(zhuǎn)錄因子載體3個(gè)。將這些載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，轉(zhuǎn)化水稻中花11產(chǎn)生各個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因家系。此外，pGOFS1空載體的轉(zhuǎn)基因家系則形成ER(EGFP-reporter)報(bào)告基因株系。 4．利用Southem雜交，鑒定了13個(gè)T<,0>代目標(biāo)基因家系的插入拷貝

5、數(shù)，以及六個(gè)模式系的轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)。并篩選2到5個(gè)表型正常的單拷貝插入目標(biāo)系用于與模式系雜交。 5．共選擇出14個(gè)目標(biāo)系做母本，與6個(gè)模式系父本進(jìn)行雜交，共計(jì)獲得50個(gè)雜交組合的雜種。 6．在ER株系與各模式系的雜交后代，發(fā)現(xiàn)GFP可以被各模式系中的GAL4-VP16所激活，并和GAL4-VP16的表達(dá)模式類(lèi)似。 7. 在雜交F<,1>代，出現(xiàn)顯性表型。這些表型包括苗期致死，延遲生長(zhǎng)，分蘗數(shù)減少，葉片變窄，葉片

6、角度增大，抽穗延遲，花粉不育，雌蕊增多等表型。并發(fā)現(xiàn)突變表型的出現(xiàn)與GFP和GUS共發(fā)生。 8. 證實(shí)了雜種P7/T11中表型的改變，如葉片下垂，葉片變窄，分蘗數(shù)減少等是由于目標(biāo)基因被反式激活的緣故。 9. 詳細(xì)鑒定了其中一個(gè)功能獲得性突變體SFL，該突變體是由P3模式系(花藥特異表達(dá))與T10目標(biāo)系(目標(biāo)基因編碼MYB同源蛋白)雜交所得，呈現(xiàn)出多子房結(jié)構(gòu)。 10．通過(guò)掃面電鏡和解剖學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，這些增多的子房是由

7、雄性器官同源轉(zhuǎn)換過(guò)來(lái)。 11. 通過(guò)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)許多控制雌性器官的基因出現(xiàn)上升表達(dá)，如C類(lèi)基因OsMADS3，OsMADS58，DL，D類(lèi)基因OsMADS13等。 12．原位雜交顯示在第三輪花器官，出現(xiàn)DL的異位表達(dá)，說(shuō)明SFL在雄蕊的激活表達(dá)引起DL的活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，另一C類(lèi)基因OsMADS3在花器官出現(xiàn)了增強(qiáng)和延伸表達(dá)。 13.SFL在雄蕊的異位表達(dá)不僅引起多雌蕊結(jié)構(gòu)發(fā)生，還誘發(fā)腫瘤樣結(jié)構(gòu)發(fā)生。通過(guò)原位雜交顯

8、示這些腫瘤樣結(jié)構(gòu)具備胚珠細(xì)胞特征。雖然SFL在花器官的表達(dá)引起了細(xì)胞增生，而在其他器官如成熟的葉片中表達(dá)則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。顯示SFL調(diào)控細(xì)胞的增生或凋亡具有細(xì)胞類(lèi)型特異性。 14. SFL屬于細(xì)胞非自主性蛋白，可以在細(xì)胞之間移動(dòng)，因而，有時(shí)在其他花器官中也建立了新的心皮結(jié)構(gòu)，如在漿片和內(nèi)稃的邊緣等區(qū)域。而自身的第四輪花器官則被誘導(dǎo)細(xì)胞增生。 15．水稻的外稃則沒(méi)有受到影響，且只有內(nèi)稃的膜狀結(jié)構(gòu)被誘導(dǎo)成柱頭狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合水稻的

9、其他相關(guān)突變體分析，可以初步認(rèn)為水稻的內(nèi)稃膜狀邊緣結(jié)構(gòu)相當(dāng)于擬南芥的花萼結(jié)構(gòu)。 16．原位雜交結(jié)果顯示SFL主要限制在花分生組織表達(dá)。 17. 共產(chǎn)生RNAi及antisense植株85株，并從中鑒定出SFL下降表達(dá)植株共4株。但這些植株均表現(xiàn)正常，暗示SFL可能屬于一個(gè)功能冗余基因。 結(jié)論：本研究在水稻中已成功地建立了GAL4/UAs雙因子異位表達(dá)技術(shù)平臺(tái)并用于鑒定和發(fā)掘基因的功能。在該系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)錄因子S