雞精原干細(xì)胞介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的研究.pdf

1、精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性生殖細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有終生擴(kuò)增性和永生性，是生殖系中唯一的在成體中還能增殖的細(xì)胞。目前，SSCs的研究對動物精子發(fā)生發(fā)育機(jī)理、醫(yī)學(xué)臨床的男性生殖生理和轉(zhuǎn)基因動物的制備方面具有廣闊的應(yīng)用前景，己成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)之一，本研究進(jìn)行了體內(nèi)、外雞SSCs轉(zhuǎn)染外源基因(pEGFP-N<,1>)建立轉(zhuǎn)基因雞的探索，對轉(zhuǎn)染后外源基因在當(dāng)代、F<,1>、F<,2>代精子

2、、種蛋胚盤及不同孵化日齡胚胎及其組織器官中的整合、表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。研究結(jié)果如下幾個方面： 1．對公雞睪丸內(nèi)注射pEGFP-N<,1>，觀察體內(nèi)精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因整合以及在后代中表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)雞在注射pEGFP-N<,1>一個生精周期(25d左右)后，定期檢測(轉(zhuǎn)染后25～240d內(nèi)，每隔l周檢測1次)公雞精子轉(zhuǎn)染表達(dá)情況及southern blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)雞在轉(zhuǎn)染70d后精子熒光表達(dá)率最高為19.1％，并維持

3、到180d后轉(zhuǎn)染率明顯下降至15％左右，此后一直保持這一轉(zhuǎn)染水平：對轉(zhuǎn)染后48h 0世代實(shí)驗(yàn)公雞睪丸細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞和10d胚齡成纖維細(xì)胞，檢測其熒光轉(zhuǎn)染率，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48h的公雞睪丸細(xì)胞表達(dá)有綠色熒光蛋白；孵化5.5d雞胚的原始生殖細(xì)胞和孵化10d的雞胚成纖維細(xì)胞綠色熒光表達(dá)率各為50.00％和66.67％；對0世代實(shí)驗(yàn)雞睪丸組織以及后代中不同組織(胚盤、胚胎、心臟、腎臟、肝臟以及肌肉)，進(jìn)行冰凍切片檢測和southern bl

4、ot檢測。結(jié)果顯示：0世代實(shí)驗(yàn)雞睪丸組織，可清晰看到曲細(xì)精管中轉(zhuǎn)染細(xì)胞繞管分布呈環(huán)狀。F<,1>、F<,2>代雞胚胎不同組織間熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)弱差異，在肝臟、腎臟表達(dá)強(qiáng)度高，其余組織熒光表達(dá)強(qiáng)度弱：未經(jīng)孵化的F<,1>、F<,2>代新生胚盤中陽性率各為71.69％和67.29％，F(xiàn)<,1>代胚盤的PCR陽性率為69.64％，孵化的胚胎PCR陽性率為60.08％，F(xiàn)<,2>代胚盤、胚胎的PCR陽性率各為61.33％和57.35％，經(jīng)sout

5、hem雜交檢測，證實(shí)外源基因(EGFP)已整合到精子基因組，且能通過體外受精在后代中穩(wěn)定表達(dá)。因此，睪丸內(nèi)注射法可能是一種可行、簡單并利于推廣的制備轉(zhuǎn)基因雞的方法。 2．對接受精原干細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)受體雞，預(yù)先進(jìn)行白消安處理，消除其內(nèi)源性精原干細(xì)胞，結(jié)果顯示：白消安處理20d后，完全消除了內(nèi)源性精原干細(xì)胞，可用于外源精原干細(xì)胞移植。電穿孔法轉(zhuǎn)染供體精原干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2d時檢測轉(zhuǎn)染率為19.70％，培養(yǎng)10d時，轉(zhuǎn)染率為4.72％：篩選

6、轉(zhuǎn)染后表達(dá)熒光蛋白的精原干細(xì)胞移植入實(shí)驗(yàn)受體雞睪丸內(nèi)，一個生精周期(25d左右)后，采集不同時間階段實(shí)驗(yàn)雞精液，進(jìn)行常規(guī)檢測，結(jié)果顯示：移植25d后，采集精液發(fā)現(xiàn)，精液呈清水狀，精子密度和熒光表達(dá)率分別為1.57(10<'4>個/ml)和4.68％，移植75d時，精液為淡白色，精子密度和熒光表達(dá)率分別為1.35(10<'5>個/ml)和8.02％；精子DNA的PCR．檢測結(jié)果為陽性。對移植75d實(shí)驗(yàn)雞睪丸組織制作冰凍切片，觀察到攜帶外源