基于高通量測序的石刁柏基因轉(zhuǎn)座子分析.pdf

1、石刁柏（AsparagusofficinalisL.）又名蘆筍、龍須菜，屬于百合科天門冬屬多年生宿根性草本植物。石刁柏是典型的雌雄異株植物，不僅可以作為研究雌雄異株植物性別決定與分化的模式植物之一，也為植物性染色體起源與進化的研究提供了良好的實驗材料。但是，目前對于石刁柏性染色體的起源和演化性別決定機制仍未獲得直接的遺傳學證據(jù)。轉(zhuǎn)座子作為一種可移動的遺傳因子廣泛存在于植物基因組中，是造成染色體不穩(wěn)定的重要因素之一，有可能是植物性染色體演

2、化的啟動器和推進器。因此，對于石刁柏基因組中轉(zhuǎn)座子的全面分析有助于獲得其性染色體起源及性別決定的早期線索。
　　基于此，本文以石刁柏為材料，在利用高通量測序技術(shù)獲得的雌、雄基因組高通量序列的基礎(chǔ)上，利用生物信息學技術(shù)對基因組中的轉(zhuǎn)座子類型、分布及拷貝數(shù)等特征進行了分析。同時，對兩個scaffolds序列進行了序列擴增克隆及鑒定，分析了序列結(jié)構(gòu)特征及和同屬近緣種間的序列變異分析，并對石刁柏的不同品種、不同單株、不同性別、不同單克隆及

3、近緣種之間的異質(zhì)性進行了比較分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.基于高通量測序技術(shù)，共獲得了17Gb的基因組序列，測序深度為12×，通過序列組裝獲得總計長約400Mbp的163406個scaffolds，占石刁柏基因組的30％，其中轉(zhuǎn)座子占石刁柏組裝序列的53％，在總的轉(zhuǎn)座子序列中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子比例最大，占到總基因組的28％。在反轉(zhuǎn)座子中，Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)要明顯高于Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。另外，

4、通過對雌、雄基因組中轉(zhuǎn)座子的比較結(jié)果表明，幾乎所有的轉(zhuǎn)座子類型在雌、雄基因組中都是高度相似的，包括反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子類型中的Ty3-gypsy、LINE和SINE，以及DNA轉(zhuǎn)座子類型中的Ac/Ds、MULE、Mariner和ping/pong/SNOOPY，它們各占雌、雄基因組的百分比差異范圍為0～0.261％;僅有個別的轉(zhuǎn)座子類型中存在有微小的差別，包括反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子類型中的Ty1-copia和DNA轉(zhuǎn)座子類型中的CACTA，兩者分別在雌、

5、雄基因組中的比例差異為1.99％和0.50％。這一結(jié)果與石刁柏性染色體起源較晚是一致的。
　　2.通過NCBI中Blastp對獲得的石刁柏的109條序列進行序列特征搜索發(fā)現(xiàn)，109條序列均為Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，其中，scaffold101366的52條序列中有25條序列為Ty1-copia逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)，有11條序列為RNA酶保守區(qū)，有17條序列既為Ty1-copia逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)，又為RNA酶保守區(qū);scaffol

6、d107518的57條序列中有36條序列為Ty1-copia逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)，有6條序列為RNA酶保守區(qū)，有15條序列既為Ty1-copia逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)，又為RNA酶保守區(qū)。因此，進一步證明所獲得的兩個scaffold序列是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列。
　　3.根據(jù)測序結(jié)果對序列scaffold101366和scaffold107518的PCR擴增結(jié)果表明，在所擴增的109條序列中序列和測序結(jié)果一致性均達到95％以上。獲得的scaffold

7、101366的序列共55條，經(jīng)多序列比對結(jié)果顯示，石刁柏的52條序列一致性為92.44％。對突變位點的分析發(fā)現(xiàn)共有326處位點發(fā)生了突變，其中發(fā)生了2082次堿基轉(zhuǎn)換，占堿基置換的80％，其中，T(→)C占51.28％，G(→)A占48.72％;508次堿基顛換(T(→)A，A(→)C，T(→)G，C(→)G)。而獲得的scaffold107518的序列共有59條，多序列比對結(jié)果表明，石刁柏的57條序列的一致性為92.13％。突變位點分

8、析結(jié)果表明，有227處突變位點，堿基轉(zhuǎn)換發(fā)生了3039次，占堿基置換的80％，其中，T(→)C占50.89％，G(→)A占49.11％;堿基顛換發(fā)生了760次。由以上結(jié)果說明，在所分析的兩個石刁柏Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子其異質(zhì)性的產(chǎn)生主要是由于堿基轉(zhuǎn)換造成的。
　　4.利用MEGA軟件對scaffold101366的55條序列構(gòu)建的進化樹表明，兩個石刁柏品種(TD818和UC309)中的Ty1-copia序列可以聚為兩個大組

9、GroupⅠ和GroupⅡ，但是，通過對兩組序列的分析發(fā)現(xiàn)序列聚類未表現(xiàn)出性別和品種的特異性;而且，和其近緣種文竹的序列相比種內(nèi)異質(zhì)性大于種間異質(zhì)性。scaffold107518的59條序列構(gòu)建的進化樹結(jié)果也表明，該轉(zhuǎn)座子在石刁柏品種間、性別間均未表現(xiàn)出特異性且石刁柏的兩個品種中的Ty1-copia序列均與文竹中的Ty1-copia序列無明顯差異。由此說明，Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在石刁柏的不同品種、不同性別、不同單克隆及近緣種中