miR-199在心肌肥厚中的功能研究.pdf

1、心血管疾病是威脅人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手，心肌肥厚是多種心血管疾病共有的病理特征之一。它是指心臟對(duì)于各種機(jī)械應(yīng)力或者神經(jīng)激素刺激的一種代償性反應(yīng)，表現(xiàn)為心臟尺寸的增大和室壁的增厚。心肌肥厚的程度對(duì)于進(jìn)行性心臟疾病具有重要的預(yù)測(cè)作用并且與預(yù)后負(fù)相關(guān)，病理性心肌肥厚最終發(fā)展為心力衰竭是導(dǎo)致心肌肥厚患者死亡的主要原因。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多重要的參與調(diào)控心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的信號(hào)通路，但是其發(fā)生的分子機(jī)制還有待更加深入的研究。因此，研究發(fā)現(xiàn)新的心肌肥厚調(diào)控

2、基因，為心肌肥厚的治療尋找新的靶標(biāo)，對(duì)于預(yù)防和治療心臟疾病具有重要的意義。
　　病理性心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展往往伴隨著心臟穩(wěn)態(tài)的失衡，而近年來(lái)的研究表明自噬在心臟穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮了極為重要的功能。自噬是指細(xì)胞自身的蛋白或者細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)包被形成自噬體，進(jìn)而與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最終溶解這些內(nèi)容物的過(guò)程。通過(guò)自噬可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身能量代謝及細(xì)胞器更新的需求，因此它是一種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要生理過(guò)程。心肌細(xì)胞自噬的異常與心肌肥厚的發(fā)

3、生和發(fā)展密切相關(guān)，但是由于自噬功能的復(fù)雜性，利用遺傳修飾小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)不同的自噬功能基因在心肌肥厚中的功能是不同的，關(guān)于自噬究竟是促進(jìn)心肌肥厚還是抑制心肌肥厚這一問(wèn)題還存在較大的爭(zhēng)議。
　　microRNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度大約為22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，廣泛地參與了各種重要的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。它們可以與靶基因 mRNA3’非翻譯區(qū)以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別并結(jié)合，通過(guò)抑制蛋白的翻譯或促進(jìn) mRNA的降解兩種方式，對(duì)靶基

4、因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一系列在心肌肥厚中發(fā)揮重要功能的miRNA，它們通過(guò)調(diào)節(jié)在心肌肥厚中重要的信號(hào)通路從而在心肌肥厚中起到有益或有害的作用。通過(guò)對(duì)這些miRNA的研究也發(fā)現(xiàn)了新的可能的心肌肥厚及心衰的臨床診斷指標(biāo)及治療靶標(biāo)。
　　miR-199a是一個(gè)重要的心肌細(xì)胞尺寸調(diào)控基因。之前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a在心衰病人標(biāo)本及病理性心肌肥厚小鼠模型中的表達(dá)均有顯著性的上調(diào)。體外研究結(jié)果顯示miR-199

5、a在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞尺寸及凋亡中發(fā)揮了重要的功能，但是關(guān)于miR-199a在小鼠體內(nèi)心臟穩(wěn)態(tài)維持中是否發(fā)揮功能以及相關(guān)的作用機(jī)制均未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在研究miR-199a的體內(nèi)功能，并探索其引發(fā)病理性心肌肥厚的分子機(jī)制。
　　我們首先在主動(dòng)脈結(jié)扎引起的小鼠心肌肥厚模型及心衰病人標(biāo)本中驗(yàn)證了miR-199a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)均有顯著性的上調(diào)。為了研究miR-199a在體內(nèi)的功能，我們建立了心肌細(xì)胞特異性miR-199a過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，

6、發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了病理性心肌肥厚及心衰。分子機(jī)制研究顯示，miR-199a在體內(nèi)外過(guò)表達(dá)均可以激活自噬抑制因子mTOR，抑制心肌細(xì)胞自噬，并且這些生物學(xué)效應(yīng)是部分通過(guò)miR-199a的靶基因GSK3β所介導(dǎo)的。進(jìn)一步在體內(nèi)外分別通過(guò)雷帕霉素處理或者過(guò)表達(dá)Atg5激活自噬過(guò)程，發(fā)現(xiàn)可以挽救由miR-199a過(guò)表達(dá)所引起的心肌肥厚表型，這些結(jié)果證實(shí)miR-199a可以通過(guò)抑制心肌細(xì)胞自噬引起病理性心肌肥厚。
　　以上結(jié)果顯示，心肌細(xì)

7、胞特異性miR-199a過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠能夠自發(fā)的發(fā)生病理性心肌肥厚，而以往有文獻(xiàn)報(bào)道心肌細(xì)胞特異性miR-199b轉(zhuǎn)基因小鼠在壓力負(fù)荷下也更容易發(fā)生心肌肥厚，提示 miR-199家族是一個(gè)重要的心肌肥厚調(diào)控家族。然而這些研究都是基于體內(nèi)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，心肌細(xì)胞內(nèi)源的miR-199家族在心臟中發(fā)揮了怎樣的功能鮮見(jiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步研究?jī)?nèi)源性miR-199在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能，我們建立了一種基于“miRNA sponge”策略

8、抑制內(nèi)源性miR-199功能的基因工程小鼠（miR-199-SP）。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-199a和miR-199b在miR-199-SP小鼠心臟組織中表達(dá)下調(diào)，而miR-199家族靶基因GSK3β、HIF1α和DYRK1A表達(dá)顯著上調(diào)，這些結(jié)果證明miR-199-SP小鼠心臟中miR-199家族的功能被有效抑制。對(duì)miR-199-SP轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)，三月齡轉(zhuǎn)基因小鼠開(kāi)始出現(xiàn)心臟質(zhì)量增加，心肌細(xì)胞尺寸增大，但心肌肥厚的程度并不

9、隨著年齡增長(zhǎng)更加顯著。心臟超聲結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能較對(duì)照小鼠無(wú)明顯異常。miR-199-SP小鼠心臟肥大標(biāo)志基因ANF表達(dá)顯著下調(diào)，BNP表達(dá)無(wú)明顯變化。Masson染色結(jié)果顯示miR-199-SP轉(zhuǎn)基因小鼠未發(fā)生纖維化等病理性重塑。分子機(jī)制研究顯示PGC1α是miR-199的靶基因，在miR-199-SP轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)升高，其調(diào)控的代謝基因上調(diào)可能是小鼠發(fā)生生理性心肌肥厚的機(jī)制之一。以上結(jié)果表明，miR-199-SP轉(zhuǎn)基因小鼠

10、發(fā)生了生理性心肌肥厚，提示內(nèi)源性miR-199家族在心臟穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮了重要的功能。
　　最后，為了探索miR-199家族是否能夠成為心肌肥厚治療的靶標(biāo)，我們利用主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)建立的病理性心肌肥厚小鼠模型進(jìn)行了治療實(shí)驗(yàn)。通過(guò)鼠尾靜脈注射表達(dá)miR-199-SP序列的腺病毒后發(fā)現(xiàn)，抑制miR-199功能可以有效地緩解由于壓力型負(fù)荷增加引起的心肌細(xì)胞尺寸的增加、肥大標(biāo)志基因的上調(diào)和心臟功能的受損，這些結(jié)果表明抑制 miR-199可以有效

11、治療壓力型負(fù)荷引起心肌肥厚及心衰。
　　綜上所述，我們利用遺傳修飾的小鼠模型首次在體內(nèi)證實(shí)了miR-199家族在心肌肥厚及心臟穩(wěn)態(tài)維持中的重要功能。發(fā)現(xiàn)miR-199a過(guò)表達(dá)靶向調(diào)節(jié)GSK3β抑制心肌細(xì)胞自噬并引起病理性心肌肥厚，而抑制內(nèi)源性 miR-199家族引發(fā)生理性心肌肥厚，同時(shí)證明miR-199家族有可能成為心肌肥厚治療的新靶標(biāo)。該研究為理解心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)，并為心肌肥厚的治療提供了新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模