miR-199a對大鼠心肌細(xì)胞自噬的調(diào)控研究.pdf

1、一、背景與目的
　　自噬是一種維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要的代謝過程，通過溶酶體降解長壽命蛋白及無功能的細(xì)胞器，從而為細(xì)胞代謝提供原料，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的存活。在自噬的發(fā)生過程中，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)的前體在ATG4的作用下轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅰ，然后再與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)結(jié)合從而形成LC3-Ⅱ

2、。在哺乳動物中，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化是自噬體形成的關(guān)鍵步驟，從而被作為最常用的檢測自噬的方法之一。
　　微小核糖核酸(microRNA，miRNA，miR-)是一種內(nèi)源性的非編碼的核糖核酸分子，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。正因為此，miRNA能夠?qū)Χ鄶?shù)生物學(xué)進(jìn)程起到調(diào)控作用，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和自噬等，從而也與包括心血管疾病在內(nèi)的很多疾病的發(fā)生、發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。MiRNA在心臟中的作用最早是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的。其后研

3、究者又發(fā)現(xiàn)了miR-208a、miR-1和miR-133等在心肌肥厚中的作用?，F(xiàn)在越來越多的研究揭示了miRNA在心肌梗死的病理生理過程中的重要作用。
　　近年來miRNA和自噬的關(guān)系正越來越受到關(guān)注。隨著首次報道m(xù)iR-30a靶向BECN1調(diào)控自噬之后，人們發(fā)現(xiàn)了很多通過自噬核心通路起作用的miRNA。在心肌細(xì)胞中Xiao等率先發(fā)現(xiàn)了miRNA調(diào)控自噬的作用。其他研究還發(fā)現(xiàn)miR-30a能夠靶向Beclin1調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬，m

4、iR-325能靶向ARC增強(qiáng)缺血/再灌注損傷下的心肌細(xì)胞自噬等等。
　　MiR-199a主要在心肌細(xì)胞中表達(dá)，并且已被發(fā)現(xiàn)與多種心血管疾病有關(guān)。我們在之前發(fā)表的文章中也發(fā)現(xiàn)miR-199a能夠調(diào)控心肌肥厚，但miR-199a與自噬在心血管系統(tǒng)中的關(guān)系尚不清楚。我們設(shè)計本研究旨在探討miR-199a在心肌細(xì)胞自噬中的表達(dá)情況及其調(diào)控作用。我們通過將離體的心肌細(xì)胞置于無血清的饑餓環(huán)境下，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生自噬，檢測miR-199a的表達(dá)

5、情況，并進(jìn)一步對心肌細(xì)胞過表達(dá)和敲低miR-199a來觀察自噬活性的變化。我們還進(jìn)一步探討了miR-199a調(diào)控饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬的潛在的靶基因。
　　二、研究方法
　?。ㄒ唬┤榇笫笮募〖?xì)胞分離和培養(yǎng)
　　原代心肌細(xì)胞取自新生2天的SD大鼠。75％酒精消毒乳鼠，于無菌環(huán)境下取出心臟，置于D-Hanks液中，去除心房保留心室，以眼科剪將心肌組織分成約1mm3大小的組織塊，并洗凈殘留的血液。以膠原酶消化后離心去除上清，

6、并采用梯度貼壁法去除成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞，保留懸浮細(xì)胞即為心肌細(xì)胞。對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)后，接種于12孔或24孔板中以備使用。細(xì)胞培養(yǎng)條件為完全DMEM培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清+1％青鏈霉素)。以平衡鹽溶液EBSS替代完全DMEM培養(yǎng)基以營造無血清、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的饑餓環(huán)境，一定時間后收取細(xì)胞供下一步檢測使用。
　?。ǘ崟r定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)
　　以Trizol常規(guī)方法抽提乳大鼠心肌細(xì)胞的RNA，使用特定的

7、引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR按照SYBR Green Mix的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行，采用Rotor-Gene RG-3000A機(jī)器進(jìn)行檢測分析。選取U6作為參照物并計算ΔCt值。采用2-ΔΔCt法計算目標(biāo)RNA的表達(dá)水平。引物序列如下所示（5'端至3'端，以下均為大鼠）:miR-199a-3p Forward，CTGAGTACAGTAGTCTGCACAT; miR-199a-5p Forward, CTGAGTCCCAGTGT-TCAGACT

8、; miRNAs common Reverse, GTGCAGGGTCCGAGGT; Twist1 Forward,CACGCTGCCCTCGGACAA; Twist1 Reverse, GGGACGCGGACATGGACC; U6Forward, CTCGCTTCGGCAGCACA, U6 Reserve, AACGCTTCACGAATTTGCGT。
　?。ㄈ┫俨《緲?gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　重組腺病毒的構(gòu)建、擴(kuò)增及滴度測定方法

9、按照Graham等提出的經(jīng)典方法實施。所有DNA均通過腺病毒轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞中。miR-199a-3p和miR-199a-5p抑制劑(inhibitor)則通過Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染進(jìn)心肌細(xì)胞。秀麗隱桿線蟲的miRNAinhibitor按照同樣的方法設(shè)計，并作為陰性對照(NC)。采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。
　?。ㄋ模┑鞍酌庖哂≯E檢測(Western blot)
　　采用Western blot檢測心肌細(xì)胞

10、中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、HSPA5和GAPDH的表達(dá)水平。心肌細(xì)胞樣品使用SDS-PAGE Loading Buffer裂解提取蛋白。根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量采用10％或15％的分離膠。常規(guī)80-120V電泳，100V、2h濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。5％脫脂牛奶封閉后，孵育一抗4℃過夜。TBST洗滌3次后，室溫下避光孵育二抗1h。采用Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)檢測分析蛋白條帶。一抗?jié)舛确謩e為:anti-LC3(1∶500)、anti-GAPDH

11、(1∶1000)、anti-HSPA5(1∶1000)。二抗?jié)舛?anti-mouse(1∶5000),anti-rabbit(1∶10000)。
　?。ㄎ澹┘?xì)胞免疫熒光檢測
　　心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板后，按實驗條件處理后，用4％多聚甲醛/PBS室溫下固定10 min，1∶1000的Triton X-100/PBS作可滲透化處理，5％山羊血清封閉30 min，與anti-LC3抗體(1∶200)室溫下孵育1h，PBS洗滌

12、3次后，加入結(jié)合Alexa Fluor594的二抗(1∶200)孵育30 min，之后以1∶1000 DAPI/PBS染核2 min。甘油封片，放置于Leica TCS SP5激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。鏡下觀察到的LC3紅色熒光小點視為細(xì)胞內(nèi)的自噬體和自噬溶酶體。
　?。┩干潆娮语@微鏡觀察
　　心肌細(xì)胞經(jīng)實驗處理后使用預(yù)冷的多聚甲醛固定后送檢。東芝H7650型透射電子顯微鏡檢測方法按照標(biāo)準(zhǔn)方法操作。透射電鏡下觀察到

13、雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡狀的自噬體作為自噬定性和定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)。
　?。ㄆ撸╇p熒光素酶報告基因
　　融合了Hspa5 mRNA3'UTR的熒光素酶質(zhì)粒和miR-199a類似物被共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后裂解細(xì)胞。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光酶活性。螢火蟲熒光素的活性使用海腎熒光素活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并對結(jié)果進(jìn)行分析。
　　（八）統(tǒng)計學(xué)分析
　　計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組實驗數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次。兩組

14、間比較采用兩獨立樣本的t檢驗。以P＜0.05作為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。
　　三、結(jié)果
　?。ㄒ唬囸I誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬
　　使用EBSS饑餓4h后心肌細(xì)胞自噬水平顯著升高。Western blot示饑餓2h時LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值開始升高，4h時顯著高于對照組。免疫熒光檢測觀察到心肌細(xì)胞內(nèi)的LC3紅色熒光小點在饑餓4h組多于對照組。我們采用透射電子顯微鏡同樣觀察到了在饑餓條件下心肌細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體的形成，而在對照組未能觀察

15、到這一現(xiàn)象。在饑餓8h時細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)凋亡征象。上述結(jié)果均證實在饑餓4h后心肌細(xì)胞的自噬被顯著激活。
　?。ǘ㏕wist1和miR-199a的表達(dá)變化
　　由于miR-199a已被證實與很多心血管疾病有關(guān)，因此我們檢測了饑餓4h后心肌細(xì)胞中miR-199a的表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果顯示在饑餓4h后，心肌細(xì)胞中miR-199a-3p和miR-199a-5p的表達(dá)量均顯著降低。為了進(jìn)一步分析miR-199a表達(dá)降低的機(jī)制，

16、我們檢測了轉(zhuǎn)錄因子Twist1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示Twist1在饑餓組的表達(dá)同樣受到了抑制。由于Twist1作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控編碼miR-199a的RNA的表達(dá)，因此可以認(rèn)為在饑餓4h時，Twist1的表達(dá)降低進(jìn)一步導(dǎo)致了miR-199a的下調(diào)，同時二者都可能與饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬有關(guān)。
　?。ㄈ┻^表達(dá)miR-199a抑制饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬
　　我們采用過表達(dá)miR-199a的方法來探討其在饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬

17、中的作用。我們首先用miR-199a過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后驗證miR-199a的表達(dá)確定轉(zhuǎn)染效率，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-199a-3p和miR-199a-5p的表達(dá)量均較GFP對照組顯著升高12-20倍，提示轉(zhuǎn)染有效。繼續(xù)用EBSS誘導(dǎo)自噬，Western blot檢測結(jié)果顯示miR-199a過表達(dá)后LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值顯著下降約52％，免疫熒光也觀察到miR-199a過表達(dá)后心肌細(xì)胞內(nèi)紅色熒光小點的數(shù)量較對照

18、組要少。上述結(jié)果均提示過表達(dá)miR-199a抑制了饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。
　?。ㄋ模┮种苖iR-199a促進(jìn)饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬
　　由于腺病毒轉(zhuǎn)然后miR-199a-3p和miR-199a-5p的表達(dá)量均顯著升高，為進(jìn)一步確認(rèn)miR-199a-3p和miR-199a-5p各自的作用，并從反面驗證miR-199a對自噬的影響，我們使用miR-199a-3p抑制物(inhibitor)和miR-199a-5p inhibi

19、tor分別處理心肌細(xì)胞。Western blot顯示抑制miR-199a-3p和miR-199a-5p的表達(dá)均能顯著升高LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值，且以抑制miR-199a-5p的作用更為顯著。免疫熒光檢測同樣發(fā)現(xiàn)，在抑制miR-199a-3p和miR-199a-5p后心肌細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光小點均較對照組增多，且在miR-199a-5p組效果更明顯。因此上述結(jié)果進(jìn)一步提示下調(diào)miR-199a-3p或miR-199a-5p的表達(dá)水平均能促進(jìn)饑餓誘

20、導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬活性，而miR-199a-5p在其中的作用可能更加顯著和主要。
　?。ㄎ澹﹎iR-199a直接抑制HSPA5表達(dá)
　　我們采用生物信息學(xué)檢索預(yù)測miR-199a可能的靶基因，從而進(jìn)一步探討miR-199a調(diào)控心肌細(xì)胞自噬的潛在機(jī)制。采用TargetScan數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白5基因(Hspa5)是miR-199a的潛在的靶基因。Hspa5編碼HSPA5蛋白，又稱GRP78，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

21、應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬中起到重要作用。通過生物信息學(xué)檢索，我們發(fā)現(xiàn)Hspa5的3'UTR含有miR-199a-5p的可能的結(jié)合位點，因此我們采用熒光素酶報告基因驗證Hspa5是否是miR-199a的靶基因。結(jié)果顯示過表達(dá)miR-199a顯著抑制了融合有Hspa5-3'-UTR的熒光素酶表達(dá)，證實Hspa5是miR-199a的直接靶基因。Western blot也進(jìn)一步驗證了在過表達(dá)miR-199a后HSPA5蛋白的表達(dá)顯著受到抑制，而敲低miR

22、-199a-3p和miR-199a-5p后都能促進(jìn)HSPA5蛋白的表達(dá)，尤其在敲低miR-199a-5p后作用更明顯。上述結(jié)果均提示miR-199a可能通過靶向Hspa5對心肌細(xì)胞自噬起調(diào)控作用。
　　四、結(jié)論
　?。ㄒ唬┮訣BSS平衡鹽溶液營造營養(yǎng)缺乏的饑餓環(huán)境能夠誘導(dǎo)離體的大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生自噬，在饑餓4h后自噬活性被顯著激活。
　　（二）在饑餓誘導(dǎo)的自噬時，心肌細(xì)胞中miR-199a的表達(dá)顯著下降，這可能是通過轉(zhuǎn)錄