miR-22對心肌細胞自噬和凋亡的調(diào)控研究.pdf

1、目的:
　　缺血性心臟病，尤其是急性心肌梗死已成為世界范圍內(nèi)人類死亡的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死發(fā)生時缺血區(qū)域既發(fā)生心肌細胞自噬也發(fā)生心肌細胞凋亡。
　　miRNA是一種小分子非編碼RNA，主要通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。本課題中我們發(fā)現(xiàn)EBSS饑餓處理后心肌細胞出現(xiàn)了明顯的自噬和凋亡，此外miR-22的表達也明顯下調(diào)，說明miR-22可能參與調(diào)控EBSS饑餓引起的心肌細胞自噬和凋亡。
　　方法:
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2、）乳鼠心肌細胞分離和培養(yǎng)
　　新生2天的SD大鼠表面消毒后取出心臟，D-hanks洗滌心臟，去除心房結(jié)構(gòu)，將心室剪成1 mm3的組織塊，然后用1％的Ⅰ型膠原酶5ml4℃冰消化過夜(18h)，然后放入細胞培養(yǎng)箱消化5-10分鐘并吹打組織塊直至消化完全，加入完全DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心后D-hanks液重懸洗滌并再次離心，沉淀用培養(yǎng)基重懸后采用差速貼壁分離出心肌細胞。以0.1 mM BrdU的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細胞，以EBSS

3、培養(yǎng)構(gòu)建心肌細胞饑餓模型。
　?。ǘ崟r定量PCR(qRT-PCR)
　　大鼠心肌細胞總RNA由Trizol方法抽提，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR按照SYBR GreenⅠ法進行，U6作為內(nèi)參。
　?。ㄈ┫俨《緲?gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染
　　miR-22過表達腺病毒的構(gòu)建按AdEasy腺病毒包裝系統(tǒng)具體方法實施，腺病毒滴度按細胞病變(CPE)法測定。miR-22 inhibitor經(jīng)Lipofectamine200

4、0包裝后轉(zhuǎn)入心肌細胞。Control inhibitor轉(zhuǎn)染的心肌細胞作為陰性對照。采用qRT-PCR檢測miR-22過表達腺病毒和miR-22 inhibitor轉(zhuǎn)染效率。
　?。ㄋ模┑鞍酌庖哂≯E檢測(Western blot)
　　采用Western blot分析心肌細胞中蛋白LC3、P62、P38α和GAPDH的表達水平。心肌細胞經(jīng)含有PMSF的RIPA裂解液裂解后提取蛋白。測定蛋白濃度后配平上樣，常規(guī)SDS-PAGE

5、電泳，1h濕轉(zhuǎn)。然后用5％脫脂牛奶封閉，孵育一抗4℃過夜，室溫孵育二抗1h。Odyssey紅外激光掃描條帶，并用軟件分析蛋白條帶。
　　（五）細胞免疫熒光和免疫組化染色
　　細胞按實驗設(shè)計接受不同處理后，用4％多聚甲醛室溫固定10min，用0.1％TritonⅩ-100室溫透膜10min，然后用5％山羊血清室溫封閉30min，加anti-LC3抗體室溫下孵育1h，PBST清洗3次，加入抗兔IgG二抗室溫避光孵育30min。0

6、.1％ DAPI染核，封片，然后激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。
　　心臟免疫組化染色，心肌組織經(jīng)4％多聚甲醛固定24h后石蠟包埋并切片。石蠟切片脫蠟并逐漸水合，然后用5％的山羊血清封閉10min，4℃孵育anti-LC3和anti-P62一抗過夜，加入二抗孵育1h，顯色劑顯色并封片。
　?。┬∈笮墓ＤＰ蜆?gòu)建
　　BALB/c小鼠麻醉后氣管插管接呼吸機，潮氣量設(shè)置為3ml，呼吸頻率150次/分，吸呼比設(shè)置為2∶1，連接

7、模擬心電儀。消毒鋪巾，在左胸處剪開約1cm長的皮膚切口;鈍性分離皮下肌肉，暴露肋骨，延第四肋間隙剪開肋間肌，進入胸腔，用撐開器撐開肋骨，沿心底部剪開心包，探查左心耳，使用8-0眼科帶針縫線，于左心耳下方2～3mm中外1/3進針，左心耳右側(cè)外源出針，打結(jié)。結(jié)扎后心臟前壁局部顏色轉(zhuǎn)為蒼白，心電圖示ST段抬高。逐層關(guān)胸。
　?。ㄆ撸┝魇郊毎麢z測
　　心肌細胞按實驗設(shè)計處理完畢后，應(yīng)用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，離心后用預冷的P

8、BS洗滌細胞兩次，再次離心后棄上清加入500μl的1×bindingbuffer再次懸浮細胞。加入5μ1 AnnexinⅤ-APC或AnnexinⅤ-FITC混勻后，室溫避光孵育15min。加入3μl PI混勻，避光孵育5min。將細胞轉(zhuǎn)入上樣管進行儀器檢測和分析。
　?。ò耍㏕UNEL和MASSON染色
　　心肌細胞凋亡是通過TUNEL染色檢測，TUNEL染色主要通過凋亡檢測試劑盒來完成，具體步驟詳見說明書。在10個隨機的

9、高倍鏡視野下計數(shù)TUNEL陽性細胞和心肌細胞總數(shù)。TUNEL陽性細胞數(shù)占總心肌細胞數(shù)的百分比定量心肌細胞凋亡率。利用Masson染色檢測心肌纖維化。Masson染色主要用masson染色試劑盒完成，具體步驟詳見說明書。
　?。ň牛╇p熒光素酶報告基因
　　將含有野生型和突變型p38α mRNA3'UTR的熒光素酶質(zhì)粒分別與miR-22類似物共轉(zhuǎn)染至293T細胞。轉(zhuǎn)染48h后裂解293T細胞，分別檢測螢火蟲螢光素酶的活力和海腎熒

10、光素酶活性，計算兩者的比值并進行統(tǒng)計分析。
　?。ㄊ┙y(tǒng)計學分析
　　使用GraphPad Prism對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。使用兩獨立樣本t檢驗對實驗組和對照組數(shù)據(jù)進行比較。以P＜0.05作為顯著性差異標準。
　　結(jié)果:
　　（一）饑餓誘導心肌細胞自噬
　　使用EBSS饑餓處理4h后心肌細胞自噬水平顯著升高。Western blot提示饑餓4h時LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值明顯升高，顯著高于

11、正常培養(yǎng)組，而P62水平則顯著低于正常培養(yǎng)組。免疫熒光檢測觀察到饑餓處理4h的心肌細胞內(nèi)的LC3紅色熒光小點聚集在細胞質(zhì)中，而熒光小點被視為自噬的標志。這些結(jié)果說明EBSS饑餓成功誘導了心肌細胞發(fā)生自噬。定量PCR結(jié)果顯示與正常培養(yǎng)組相比，EBSS饑餓處理后miR-22的表達明顯下調(diào)，其中饑餓處理4小時miR-22下調(diào)最為明顯。
　?。ǘ﹎iR-22促進饑餓誘導的心肌細胞自噬
　　我們首先利用miR-22過表達腺病毒轉(zhuǎn)染心

12、肌細胞實現(xiàn)miR-22過表達，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-22腺病毒轉(zhuǎn)染的心肌細胞中miR-22的表達量升高了14倍，說明miR-22腺病毒的高效性。然后腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞48h后繼續(xù)用EBSS饑餓誘導自噬，Western blot檢測結(jié)果顯示miR-22過表達后LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值顯著提高，同時P62的水平明顯下降，免疫熒光檢測也發(fā)現(xiàn)miR-22過表達后心肌細胞內(nèi)紅色熒光點的數(shù)量明顯增多。上述結(jié)果說明過表達miR-22促進了饑餓誘導

13、的心肌細胞自噬。此外小鼠心梗模型中miR-22過表達的心肌中LC3水平更高而P62水平更低，說明miR-22過表達后心肌中的自噬水平也明顯升高。為進一步從反面驗證miR-22對自噬的影響，我們使用miR-22 inhibitor處理心肌細胞。qRT-PCR結(jié)果顯示miR-22 inhibitor轉(zhuǎn)染后miR-22被明顯下調(diào)。Western blot顯示下調(diào)miR-22的表達能顯著減少LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值，但能增加P62的水平。免疫熒光檢

14、測同樣發(fā)現(xiàn)miR-22下調(diào)后心肌細胞內(nèi)的紅色熒光點明顯減少。因此上述結(jié)果提示miR-22能提高饑餓誘導的心肌細胞自噬活性。
　?。ㄈ﹎iR-22抑制饑餓誘導的心肌細胞凋亡。
　　除了發(fā)生心肌細胞自噬，EBSS培養(yǎng)的心肌細胞也出現(xiàn)了明顯的凋亡。流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)在相同的饑餓條件下與對照組相比，miR-22過表達的心肌細胞發(fā)生更少的凋亡，表現(xiàn)出更低的凋亡率。為了研究內(nèi)源性miR-22對于心肌細胞凋亡的調(diào)控作用，我們同樣利用miR

15、-22 inhibitor敲低心肌細胞內(nèi)的miR-22的水平，同時以control inhibitor做為陰性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同的饑餓條件下與對照組相比，miR-22下調(diào)后的心肌細胞發(fā)生更明顯的凋亡，表現(xiàn)出更高的凋亡率。此外在小鼠心梗模型中，與對照組相比，miR-22過表達的心肌表現(xiàn)出更少的TUNEL陽性的凋亡細胞，說明miR-22過表達后抑制了缺血引起的心肌細胞凋亡。這些結(jié)果說明miR-22能抑制饑餓誘導的心肌細胞凋亡。
　　

16、（四）miR-22通過抑制p38α表達調(diào)控心肌細胞自噬和凋亡。
　　我們利用生物學信息數(shù)據(jù)庫篩選miR-22在心肌細胞中的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)p38α是miR-22的潛在的靶基因。生物信息學檢索發(fā)現(xiàn)p38α的3'UTR含有miR-22的可能的結(jié)合位點。因此我們首先利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證p38α是否是miR-22的靶基因。結(jié)果顯示過表達miR-22可以抑制攜帶野生型p38α3'-UTR序列載體的螢火蟲熒光素酶活性，但對攜帶p38α3

17、'-UTR突變序列的載體的螢火蟲熒光素酶活性無影響，證實了p38α是miR-22的直接靶基因。Western blot也進一步驗證了在過表達miR-22后P38α蛋白的表達顯著受到抑制，而敲低miR-22后能促進P38α蛋白的表達。上述結(jié)果均提示miR-22可能通過靶向p38α對心肌細胞自噬和凋亡起調(diào)控作用。
　　結(jié)論:
　　（一）EBSS平衡鹽溶液饑餓處理心肌細胞能夠成功誘導離體的大鼠心肌細胞發(fā)生自噬。
　?。ǘ┰?/p>

18、心肌細胞饑餓模型中，心肌細胞中miR-22的表達顯著下降，且在饑餓4h時下降最為明顯。
　?。ㄈ┻^表達miR-22能顯著促進饑餓誘導的心肌細胞自噬，而敲低miR-22后則能抑制心肌細胞自噬的活性。
　?。ㄋ模┻^表達miR-22能顯著抑制饑餓誘導的心肌細胞凋亡，而敲低miR-22后則能促進心肌細胞凋亡的發(fā)生。
　?。ㄎ澹﹎iR-22靶向作用于p38α并直接抑制p38α的表達，并可能通過這條途徑促進了饑餓誘導的心肌細胞自