我國(guó)豬鏈球菌2型新毒力因子的研究.pdf

1、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)是一種重要的人獸共患病病原菌,能引起人和豬的腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥以及突發(fā)性死亡。中國(guó)于1998年和2005年在江蘇和四川局部地區(qū)暴發(fā)了較大規(guī)模的豬及其人感染豬鏈球菌病例,累計(jì)報(bào)告人感染豬鏈球菌病例達(dá)204例,其中死亡38例,不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大威脅,而且嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生安全。值得注意的是兩度人重癥感染死亡病例多表現(xiàn)為中毒樣休克綜合征。迄今為

2、止,對(duì)豬鏈球菌毒力因子的認(rèn)識(shí)非常有限,基本得到確認(rèn)的毒力因子有莢膜多糖(CPS)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素(SLY)等,但由于毒力因子的多樣性和復(fù)雜性,單靠現(xiàn)有毒力因子還不足以解釋導(dǎo)致我國(guó)兩度暴發(fā)豬鏈球菌病的原因。因此,分離和鑒定更多的SS2毒力因子已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　微生物蛋白質(zhì)組學(xué)是發(fā)掘新型毒力因子的有效手段。本課題組前期利用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)我國(guó)流行株的細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國(guó)流行

3、株細(xì)胞壁上存在著8個(gè)不同的抗原,具有很好的免疫保護(hù)原性,是潛在的毒力因子。
　　目前已完成測(cè)序的豬鏈球菌菌株有歐洲株p1/7和美洲株89/1591。2005年中科院基因組研究所完成了98和05年暴發(fā)流行株98HAH12和05ZYH33的測(cè)序工作,并完成了無毒株05HAS68的草圖用作比較研究,結(jié)果顯示在中國(guó)流行株中存在一個(gè)大小為89kb的可能毒力島PAI,命名為89K。序列比對(duì)和實(shí)驗(yàn)證明89K僅在中國(guó)流行株中存在。因此,89K毒力

4、島很可能是導(dǎo)致我國(guó)豬鏈球菌病暴發(fā)流行的因素之一。對(duì)89K進(jìn)一步功能注釋結(jié)果顯示89K上可能與毒力相關(guān)的基因有:3個(gè)控制物質(zhì)運(yùn)輸?shù)腁BC transporter,2個(gè)雙組分系統(tǒng)(TCSTS),3個(gè)Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)的組件。
　　本研究主要從兩個(gè)方面對(duì)中國(guó)豬鏈球菌2型毒力因子進(jìn)行探討,一是表面蛋白上5個(gè)基因的分析和鑒定,二是89K毒力島上ABC transporter上3個(gè)基因的分析和鑒定。表面蛋白上的5個(gè)基因是05SSU_02

5、72、05SSU_1000、05SSU_1538、05SSU_1083、05SSU_1664,89K毒力島上的3個(gè)基因是05SSU_0910、05SSU_0946和05SSU_0948。論文分三個(gè)部分對(duì)這些潛在毒力因子進(jìn)行闡述。
　　首先是免疫原性蛋白05SSU_0272及毒力的分析。05SSU_0272是新發(fā)現(xiàn)的豬鏈球菌表面蛋白,具有較強(qiáng)的免疫原性,在大鼠抗血清調(diào)理人全血?dú)⒕囼?yàn)中的殺菌率在50％以上。對(duì)05SSU_0272序列

6、分析發(fā)現(xiàn)其含有LPXTG基序,含有該基序的表面蛋白在許多致病菌中都有發(fā)現(xiàn)。分析蛋白序列發(fā)現(xiàn)該蛋白含有2個(gè)高度一致的重復(fù)序列,且該重復(fù)序列在不同菌株中存在多態(tài)性。05SSU_0272在GeneBank上功能注釋為延伸因子,但是突變株Δ0272表達(dá)譜結(jié)果發(fā)現(xiàn),受其影響的基因只有為數(shù)不多的幾個(gè),說明它可能不是延伸因子,而是另具其它功能的蛋白。通過同源重組方法獲得05SSU_0272突變株Δ0272,同時(shí)構(gòu)建其互補(bǔ)株CΔ0272。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)

7、現(xiàn),Δ0272對(duì)Hep2細(xì)胞的黏附能力明顯降低而CΔ0272又重新恢復(fù)了Δ0272的黏附能力,掃描電鏡同時(shí)印證了這個(gè)結(jié)果;全血?dú)Y(jié)果表明,Δ0272在人全血中抵御血液中天然免疫細(xì)胞的吞噬和殺菌能力減弱,更容易被宿主清除,而CΔ0272重新恢復(fù)了其在血中的存活能力;CD1小鼠競(jìng)爭(zhēng)感染實(shí)驗(yàn)說明突變株的增殖受到了野生株的抑制;CD1小鼠腦膜炎感染實(shí)驗(yàn)中突變株與野生株在72h血中菌數(shù)一致而在72h腦中野生株菌數(shù)為突變株的幾十倍,說明野生株比突

8、變株通過血腦屏障能力強(qiáng);豬競(jìng)爭(zhēng)感染實(shí)驗(yàn)中CI值小于0.001,說明突變株較野生株而言更容易被清除。結(jié)果表明該蛋白很可能是豬鏈球菌潛在的毒力因子,但其在豬鏈球菌致病過程中的具體作用還需進(jìn)一步研究。
　　05SSU_1000、05SSU_1538、05SSU_1083、05SSU_1664是通過蛋白質(zhì)組學(xué)同時(shí)發(fā)現(xiàn)的新型免疫原性蛋白,WB結(jié)果顯示05SSU_1664可能為我國(guó)高致病株與普通致病株及國(guó)外菌株的差異表達(dá)蛋白;05SSU_15

9、38、05SSU_1083重組抗原在6名病人和5名健康人血清中的抗體水平表現(xiàn)出顯著性差異;05SSU_1538、05SSU_1083、05SSU_1664重組抗原的抗體在人工感染小型豬前后血清中的變化情況統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著;05SSU_1083在大鼠抗血清調(diào)理人全血?dú)⒕囼?yàn)中的殺菌率達(dá)到50％以上。序列分析發(fā)現(xiàn),05SSU_1000、05SSU_1538、05SSU_1664含有LPXTG基序和信號(hào)肽序列,05SSU_1083含有信號(hào)肽序

10、列,含有這些序列的表面蛋白很可能與毒力相關(guān)。本研究對(duì)這4個(gè)基因嘗試了敲除工作,獲得了這幾個(gè)新型免疫原性蛋白的突變株。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Δ1664對(duì)Hep2細(xì)胞的黏附率10.82％低于野生株05ZYH33的黏附率14.16％且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Δ1083對(duì)Hep2細(xì)胞的黏附率13.25％低于野生株05ZYH33的黏附率15.47％;全血?dú)Y(jié)果表明,野生株05ZYH33在人全血中殺傷率為33.96％,Δ1000為72.95％,Δ1538、Δ1

11、664、Δ1083分別為28.06％、37.60％、27.74％,結(jié)果說明Δ1000在人的全血中抵御血液中天然免疫細(xì)胞的吞噬和殺菌能力減弱;CD1小鼠競(jìng)爭(zhēng)感染實(shí)驗(yàn)中Δ1000、Δ1538、Δ1664、Δ1083與野生株的競(jìng)爭(zhēng)感染指數(shù)分別為:0.60±0.24、0.61±0.16、0.82±0.29、0.77±0.30,說明這些突變株的增殖受到了野生株的抑制;CD1小鼠腦膜炎感染實(shí)驗(yàn)中Δ1000、Δ1538和Δ1664與野生株05ZYH3

12、3在血中菌數(shù)一致而在腦中野生株菌數(shù)為突變株的幾十倍,說明野生株比突變株通過血腦屏障能力強(qiáng),Δ1083與野生株05ZYH33在血中和腦中菌數(shù)一致;豬競(jìng)爭(zhēng)感染實(shí)驗(yàn),05ZYH33/Δ1664組在12h、24h、36h和48h的CI值分別為1.45、0.30、0.27、0.07,05ZYH33/Δ1083組在12h、24h、36h和48h的CI值分別為0.45、0.32、0.25、0.07,05ZYH33/Δ1000在12h、24h、36h、

13、48h和60h的CI值分別為0.11、0.07、0.37、0.13、0.008,CI值小于0.1,說明這些突變株的增殖受到了野生株的抑制。結(jié)果表明這些免疫原性蛋白可能影響到我國(guó)豬鏈球菌2型的毒力,是潛在的毒力因子。
　　ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能參與毒素的輸出,與細(xì)菌的致病性和多藥耐藥相關(guān)。認(rèn)為89K毒力島可能是導(dǎo)致中國(guó)豬鏈球菌病暴發(fā)流行的因素之一。實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了05SSU_0910、05SSU_0946和05SSU_0948這3個(gè)基因

14、的插入失活體,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與野生株相比毒力降低,因此,構(gòu)建了敲除突變體來消除失活突變體帶來的極性影響。從溶血活性來看,野生株和突變株并無差異,但生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn),Δ0948的生長(zhǎng)速度要明顯慢于野生株和其它突變株。Δ0948的Hep2細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、CD1小鼠實(shí)驗(yàn)、豬競(jìng)爭(zhēng)感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明其可能與毒力相關(guān)。Δ0946豬競(jìng)爭(zhēng)感染實(shí)驗(yàn)說明其可能與毒力相關(guān)。Δ0910體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)說明其可能與毒力無關(guān)。89K毒力島是否真是導(dǎo)致我國(guó)豬鏈球菌病暴發(fā)的因素之