BVDV囊膜蛋白E0、E1和E2基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(Bovineviraldiarrhea-mucosaldiseasevirus，BVDV)是黃病毒科、瘟病毒屬(FlaviviridaePestivirus)的成員，主要引起牛病毒性腹瀉-粘膜病(BVD-MD)，癥狀為腹瀉，急、慢性粘膜病，持續(xù)性感染與免疫耐受，免疫抑制，母畜流產(chǎn)、死胎和畸胎等。該病主要發(fā)生于牛，犢牛更易感，還可感染其它動(dòng)物及人。牛病毒性腹瀉粘膜病是全球性傳染病，具有較高的感染率，我國(guó)二十幾個(gè)省

2、市自治區(qū)均存在本病，且在各易感動(dòng)物群中的感染已呈日益擴(kuò)大趨勢(shì)。且常規(guī)的BVDV疫苗不能提供有效的保護(hù)，因此從分子生物學(xué)水平上對(duì)該病原進(jìn)行研究具有重要的意義。 BVDVE0、E1和E2基因位于基因組5’端的三分之一部分，分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(囊膜蛋白E0、E1和E2)，囊膜蛋白E0和E2具有抗原性，而E1的抗原性未見(jiàn)有報(bào)道。根據(jù)GenBank中BVDVOsloss株基因組序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，應(yīng)用RT-PCR方法體外擴(kuò)增BVDVVE

3、DEVAC-Like株E0基因，將其克隆至pMD18-T載體，序列測(cè)定及同源性分析表明，BVDVVEDEVAC-Like株E0基因與BVDVVEDEVAC(AJ585412)、Osloss(M96687)、NADL(AJ133738)、SD1(M96751)及OregonC24V(AF091605)株E0基因核苷酸同源性分別為99.41％～80.91％。根據(jù)這一結(jié)果，參考GenBank上發(fā)表的BVDVVEDEVAC株基因組序列設(shè)計(jì)二對(duì)引

4、物，應(yīng)用RT-巢式PCR(RT-nestedPCR)方法擴(kuò)增E2基因，并進(jìn)行序列測(cè)定及同源性分析，結(jié)果表明BVDVVEDEVAC-Like株E2基因與BVDVVEDEVAC(AJ585412)、Osloss(M96687)、SD1(M96751)、OregonC24V(AF091605)及NADL(AJ133738)株E2基因核苷酸同源性分別為98.58％～72.82％。根據(jù)E2基因測(cè)序結(jié)果，參考GenBank上發(fā)表的BVDVVEDEV

5、AC株基因組序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增E1基因，并進(jìn)行序列測(cè)定及同源性分析，結(jié)果表明BVDVVEDEVAC-Like株E1基因與BVDVVEDEVAC(AJ585412)、Osloss(M96687)、SD1(M96751)、OregonC24V(AF091605)及NADL(AJ133738)株核苷酸同源性分別為100％～76.75％。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明BVDVVEDEVAC-Like株E0、E1和E2基因與VEDEVAC株親源關(guān)系較近

6、。 利用DNA重組技術(shù)，將BVDVE0、E1和E2基因分別亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1，構(gòu)建E0、E1和E2基因重組原核表達(dá)載體pGEX-6P-E0、pGEX-6P-E1和pGEX-6P-E2。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至工程菌，在IPTG誘導(dǎo)下重組質(zhì)粒pGEX-6P-E0、pGEX-6P-E1和pGEX-6P-E2均得到成功表達(dá)。本研究克隆BVDVE0、E1和E2基因，并將其在原核系統(tǒng)中表達(dá)，旨在為基因工程診斷抗原和亞單位疫