伴t(11;21)(q12;q22)的急性髓系白血病融合基因的克隆及初步功能研究.pdf

1、蘇州大學(xué)博士學(xué)位論文伴t（1121）（q12q22）的急性髓系白血病融合基因的克隆及初步功能研究姓名：戴海萍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（血液學(xué)）指導(dǎo)教師：薛永權(quán)20080401伴t(1l；21q12；q22)的急性髓系白血病融合基因的克隆及初步功能研究中文摘要驗(yàn)均獲得患者知情同意。2采用3cDNA末端快速擴(kuò)增(3RapidAmplificationofeDNAEnds，3RACE)技術(shù)克隆該易位中AMLl的新伙伴基因(位于1lql2

2、的LPXN基因)；通過(guò)RTPCR以AMLl和LPXN基因特異性引物從患者骨髓標(biāo)本擴(kuò)增融合基因AMLlLPXN及LPXNAMLl轉(zhuǎn)錄本；設(shè)計(jì)同一基因位于易位斷裂點(diǎn)兩側(cè)的引物以RTPCR檢測(cè)患者未被累及的AMLl及LPXN等位基因的表達(dá)；根據(jù)后續(xù)功能研究的需要分別將AMLIB、LPXN、AMLlLPXN(代表轉(zhuǎn)錄本AL、ALs)及LPXNAMLI的全長(zhǎng)編碼區(qū)(codingsequence，CDS)克隆到真核表達(dá)載體pEGFPN1及pcDNA

3、31／myehisB，將CBFl3全長(zhǎng)CDS分別克隆到pDsRed2C1及peDNA31／mychisB載體。所構(gòu)建的全部克隆均送測(cè)序鑒定。3采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染觀察野生型AMLlB、CBFl3、LPXN及融合基因AL、ALs、LPXNAMLl翻譯成的蛋白在NIH3T3細(xì)胞中的亞定位。4利用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophorefiemobilityshiftassayEMSA)觀察融合蛋白AL、ALs與含AMLl核心序列的DNA探針的結(jié)合；

4、采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)觀察融合蛋白對(duì)野生型AMLlB轉(zhuǎn)錄活性的影響。5篩選穩(wěn)定高表達(dá)LPXN基因及融合基因AL、ALs、LPXNAMLl的NIH3T3細(xì)胞，通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)和BALB／e裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)觀察這些基因?qū)φIH3T3細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化能力。結(jié)果1常規(guī)核型分析從該例患者骨髓標(biāo)本檢測(cè)到一種新的染色體異常：t(11；21)(q173；q22)，其經(jīng)PHA刺激的外周血標(biāo)本為正常核型。染色體涂染及MFISH證實(shí)1