miR-193a在t(8;21)易位的急性髓系白血病發(fā)生中的作用及功能研究.pdf

1、目的：t(8；21)(q22；q22)易位是急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)中最常見的染色體易位，易位主要累及21號染色體的急性粒細胞白血病基因1(AML1)和8號染色體的髓系轉(zhuǎn)化基因8(ETO基因或者MTG8)，最終形成AML1-ETO融合基因，它在所有的AML中其發(fā)生率為12％～15％，在M2型AML中發(fā)生率為40％～80％。目前認為由t(8；21)易位形成的AML1-ETO融合蛋白主要是通過其

2、ETO部分的結(jié)構(gòu)域募集N-CoR/HDAC/DNMT復合物而抑制AML1靶基因轉(zhuǎn)錄，從而使AML1靶基因表達沉默；AML1-ETO也可以誘導一些基因的轉(zhuǎn)錄(如c-jun)導致細胞周期失控引起細胞增殖；AML1-ETO還能選擇性抑制粒細胞分化，抑制正常造血功能。目前認為AML1-ETO的形成會增加基因組的不穩(wěn)定性，從而對一些重要基因產(chǎn)生影響，研究表明c-kit表達產(chǎn)物的功能性激活與AML的發(fā)生密切相關(guān)(大約有70％的AML病人c-kit受

3、體陽性)，特別是在t(8；21)易位的AML中，c-kit的陽性率極高。目前認為t(8；21)易位產(chǎn)生的AML1-ETO融合蛋白引起的造血分化受抑和隨后的凋亡受抑，再加上持續(xù)活化的C-KIT、賦予造血細胞以增殖和生存優(yōu)勢，兩者協(xié)同引起AML的發(fā)生，這就是白血病發(fā)生的二次打擊學說。C-KIT是Ⅲ型跨膜蛋白酪氨酸激酶受體蛋白家族成員之一，研究表明C-KIT的持續(xù)性激活會引起PI3K/AKT信號途徑的異?；罨瘡亩鴮е录毎鲋?，凋亡受抑。Mdm

4、2和Cyclin D1都是PI3K/AKT信號途徑中的關(guān)鍵分子，它們的異常能直接導致細胞的凋亡和增殖。已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)MDM2和CCND1的突變與擴增。Mdm2是P53腫瘤抑制因子的負調(diào)控因子和效應基因，它的轉(zhuǎn)錄可以被p53激活，但是如果p53穩(wěn)定在一個水平而Mdm2卻被持續(xù)激活，這樣就會造成Mdm2的高水平，從而通過PI3K/AKT信號途徑抑制細胞凋亡。CCND1編碼Cyclin D1蛋白，屬于細胞周期蛋白家族，Cyclin D1具

5、有CDK激酶的功能，它能夠控制G1/S期的轉(zhuǎn)換。Cyclin D1的突變、擴增都會引起細胞周期的失控，并且它還和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MiR-193a是我們在AML1-ETO陽性的細胞系和臨床樣本中篩選到的能夠抑制融合蛋白AML1-ETO和C-KIT的一個microRNA。miR-193a能結(jié)合在AML1-ETO的3’UTR并抑制其翻譯，有意思的是，AML1-ETO融合蛋白反過來也能夠結(jié)合到miR-193a的核心啟動子區(qū)并招募DNMT

6、、HDAC對其表觀沉默，這樣AML1-ETO/DNMTs/HDACs共抑制復合物和miR-193a即形成一個負反饋抑制環(huán)路：miR-193a還能作用于c-kit的3’UTR，從而降低C-KIT的表達。本研究旨在探討t(8；21)易位急性髓系白血病中，miR-193a對細胞分化、細胞凋亡和細胞增殖的影響。
　　 材料與方法：構(gòu)建CCND1、MDM2的3’UTR雙熒光素酶報告載體pGL3-M-CCND1-3’UTR，pGL3-M-M

7、dm2-3’UTR和miR-193a的表達載體pCDNA3-0-miR-193a，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-193a對CCND1、MDM2的3’UTR區(qū)的結(jié)合情況。RT-PCR和Western Blot檢測臨床病人樣本和正常人中以及細胞系中AML1/ETO、miR-193a、MDM2、CCND1、P53、BCL-2的mRNA水平和蛋白水平。用流式細胞術(shù)檢測miR-193a處理的細胞的分化、凋亡和周期。最后在裸鼠體內(nèi)驗證miR-19

8、3a對Mdm2、Cyclin D1的抑制作用以及其腫瘤抑制功能。
　　 結(jié)果：雙熒光素酶報告實驗說明miR-193a能直接作用于CCND1、MDM2的3’UTR，也即Mdm2和Cyclin D1是miR-193a的靶蛋白；RT-PCR和Western Blot驗證miR-193a對MDM2、CCND1表達的影響，結(jié)果說明miR-193a能夠下調(diào)Mdm2和Cyclin D1的表達，同時Mdm2下游的Bc1-2表達也下調(diào)，p53與M

9、dm2的水平達到一種正常的平衡；用流式細胞儀檢測miR-193a處理后的細胞，發(fā)現(xiàn)細胞不僅能發(fā)生分化而且細胞的凋亡增加，大部分細胞被阻滯在G1期，S和G2期細胞比例大幅下降；細胞克隆形成試驗證明miR-193a能明顯抑制細胞的增殖，同時觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-193a的SKNO-1細胞的形態(tài)，其細胞核質(zhì)比明顯降低，說明miR-193a能促進細胞分化；體內(nèi)實驗驗證了miR-193a具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，是一個抑癌基因。
　　 結(jié)