曼氏裂頭蚴cDNA序列的測(cè)定及Sm18抗原基因的初步鑒定.pdf

1、曼氏裂頭蚴病是由曼氏迭宮絳蟲(chóng)(Spirometra mansion，Sm)的幼蟲(chóng)一曼氏裂頭蚴(plerocercoid)侵入機(jī)體引起的一種人獸共患性疾病。裂頭蚴侵入皮下組織形成結(jié)節(jié)，最大危害在于侵入艮部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可致殘、嚴(yán)重危及生命[1]。我國(guó)已報(bào)道千余例曼氏裂頭蚴病例，廣泛分布于23個(gè)省、市、自治區(qū)[2]。
　　 裂頭蚴在人體內(nèi)移行，寄生部位多變，缺乏特異性臨床表現(xiàn)，容易引起誤診、漏診。診斷常用方法主要有病原學(xué)、影像學(xué)和

2、免疫學(xué)方法。目前，我國(guó)曼氏裂頭蚴病診斷標(biāo)準(zhǔn)尚不明確，亦無(wú)商品化的診斷試劑面市，此病最終通過(guò)手術(shù)或活檢得以確診和治療。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)的普及，裂頭蚴病，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)病例的報(bào)道越來(lái)越多，CT、MRI、超聲檢查等影像學(xué)檢查亦是一種重要的輔助診斷。但是曼氏裂頭蚴感染者往往起病隱匿，局部包塊影像學(xué)表現(xiàn)與腫瘤難以區(qū)分，往往被誤診、漏診。免疫學(xué)檢測(cè)方法有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：敏感性高、簡(jiǎn)捷同時(shí)創(chuàng)傷性小，是一種較為理想的臨床輔助診斷手段。但是，

3、曼氏裂頭蚴與其它寄生蟲(chóng)尤其是蠕蟲(chóng)之間存在較為嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，粗抗原作為診斷抗原敏感性較高，但特異性差，故其免疫學(xué)診斷的準(zhǔn)確性不夠高。因此，利用基因重組技術(shù)制備曼氏裂頭蚴特異性抗原，對(duì)曼氏裂頭蚴病免疫診斷具有重要意義。
　　 目的：
　　 構(gòu)建了曼氏裂頭蚴cDNA文庫(kù)并進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序篩選和生物信息學(xué)分析，并從中挑選具有潛在診斷價(jià)值的抗原基因進(jìn)行克隆表達(dá)，在此基礎(chǔ)上對(duì)候選分子的免疫學(xué)特性以及診斷價(jià)值進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為曼氏裂頭

4、蚴的致病性及診斷方法的研究提供基因譜信息及進(jìn)一步研制曼氏裂頭蚴免疫診斷試劑盒提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.曼氏裂頭蚴cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、篩選及生物信息學(xué)分析
　　 利用SMART技術(shù)構(gòu)建曼氏裂頭蚴全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取克隆，搖菌后提取質(zhì)粒，使用通用引物PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物大?。?00bp片段進(jìn)行測(cè)序。對(duì)得到的有效序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，經(jīng)編輯后的序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST

5、N、BLASTX軟件進(jìn)行分析，選取有診斷意義的基因?yàn)楹蜻x基因。
　　 2.候選基因的克隆、表達(dá)用其免疫學(xué)特性分析
　　 采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增出候選克隆的插入片段，運(yùn)用直接測(cè)序技術(shù)測(cè)定插入cDNA片段的核苷酸序列，經(jīng)編輯后的序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTN、BLASTX軟件及其他生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行分析。PCR擴(kuò)增侯選基因開(kāi)放讀碼框，克隆到載體pET32a(+)中，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化重組蛋白后對(duì)重組蛋

6、白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。提取曼氏裂頭蚴的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合為cDNA，設(shè)計(jì)侯選基因的特異性引物，采用RT-PCR對(duì)候選編碼基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。用純化的重組蛋白免疫小鼠，制備抗血清，以該血清作為探針，對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western blot。以曼氏裂頭蚴感染者的血清作為免疫探針，純化的重組蛋白作為抗原進(jìn)行Western blot分析。以純化融合蛋白為抗原，包被酶聯(lián)免疫反應(yīng)板，用間接ELISA法檢測(cè)曼氏裂頭蚴感染者血清，評(píng)價(jià)其敏感性和特異性。應(yīng)用

7、已優(yōu)化的ELISA檢測(cè)體系，以重組Sm18作為包被抗原，對(duì)其診斷曼氏裂頭蚴感染的敏感性和特異性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果:
　　 1.曼氏裂頭蚴cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、篩選及生物信息學(xué)分析結(jié)果
　　 成功構(gòu)建了曼氏裂頭蚴cDNA文庫(kù)，從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取530個(gè)克隆，擴(kuò)增其插入片段，將條帶＞500bp的487個(gè)PCR產(chǎn)物送測(cè)序，得到418條有效序列，通過(guò)聚類(lèi)分析合并為325條序列，其中全長(zhǎng)序列139條，為曼氏裂頭

8、蚴的致病性及診斷抗原的研究提供了有價(jià)值的基因表達(dá)譜信息。序列分析發(fā)現(xiàn)，第81號(hào)克隆序列編碼與GenBank中的TSES33 diagnostic antigen[Taenia solium]Genebank：CAX86983.1具有一定同源性，可能有作為診斷抗原的研究?jī)r(jià)值，其理論分子量為18kDa，為此，將該基因暫時(shí)命名為曼氏裂頭蚴診斷抗原18(diagnostic antigen ofSparganum mansion Sm18)基因

9、，并進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　　 2.Sm18的重組表達(dá)及免疫學(xué)特性鑒定結(jié)果
　　 經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序驗(yàn)證該目的基因克隆成功。將成功構(gòu)建的重組子pET32a(+)-Sm18經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在較寬的溫度范圍和IPTG誘導(dǎo)濃度范圍內(nèi)都獲得了很好的表達(dá)；His親和層析柱純化的重組表達(dá)產(chǎn)物(rSm18)分子大小約為35kDa經(jīng)質(zhì)譜鑒定，證明是Sm18蛋白。采用RT-PCR對(duì)候選編碼基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明Sm18在曼氏

10、迭宮絳蟲(chóng)中絳期-裂頭蚴有轉(zhuǎn)錄。以制備的rSm18多抗血清為一抗進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示重組蛋白識(shí)別到一大小約33kDa的條帶。純化后的重組蛋白rSm18能被曼氏裂頭蚴感染者血清所識(shí)別，Western Blot鑒定發(fā)現(xiàn)在33kDa左右處可見(jiàn)一條明顯的免疫反應(yīng)帶，而陰性對(duì)照血清在相應(yīng)的位置未識(shí)別出該蛋白條帶。以rSm18作為抗原，建立了基于ELISA的檢測(cè)特異性抗體的免疫學(xué)方法，rSm18的最佳包被濃度為12.5μg/ml，最

11、適封閉條件為5％脫脂牛奶，37℃封閉1.5h；最適血清反應(yīng)條件為1∶400稀釋?zhuān)?7℃溫育90min；酶標(biāo)二抗1∶20000稀釋?zhuān)?7?！鏈赜?h；以TMB顯色2min左右為佳。間接ELISA方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清以可溶性粗抗原(PSA)為包被抗原檢測(cè)敏感性為90％，特異性為68％，符合率73％；以rSm18為包被抗原檢測(cè)感染者以及非感染者的血清敏感性為92％，特異性為81％，符合率為84％。
　　 結(jié)論:
　　 獲得了325條

12、曼氏裂頭蚴表達(dá)基因的EST序列，其中全長(zhǎng)序列139條，為曼氏裂頭蚴的致病性及診斷抗原的研究提供了有價(jià)值的基因表達(dá)譜信息。從曼氏裂頭蚴cDNA文庫(kù)中分離到診斷抗原(Sm18)，并成功構(gòu)建了該基因的高效原核重組表達(dá)體系，制備了可以用于免疫診斷的重組抗原。Western blot結(jié)果初步顯示rSm18具有較好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。以該分子作為抗原檢測(cè)曼氏裂頭蚴感染者血清中特異性IgG具有較高的特異性和敏感性。本研究證明rSm18在曼氏裂頭蚴