裂頭蚴河南不同地理株的蟲(chóng)種鑒定、遺傳變異及抗原多肽基因的表達(dá)及鑒定.pdf

1、裂頭蚴病（sparganosis）主要是由曼氏迭宮絳蟲(chóng)(Spirometra mansoni)幼蟲(chóng)-裂頭蚴(sparganum)感染而引起的一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病，該病呈世界性分布。裂頭蚴感染人體后，可在各種組織器官內(nèi)移行引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致皮下包塊、失明、肢體麻痹、癲癇、甚至死亡。傳統(tǒng)的迭宮屬絳蟲(chóng)的鑒別主要是通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定，而迭宮屬絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)階段缺乏形態(tài)學(xué)特征難以鑒別，因此，應(yīng)用分子生物學(xué)方法對(duì)迭宮屬絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定及遺傳變異分

2、析，對(duì)裂頭蚴病的防治具有重要意義。此外，裂頭蚴含有重復(fù)序列的抗原多肽（antigenic polypeptide，SAP，GenBank No.AB019222.1）可能是裂頭蚴的保護(hù)性抗原，對(duì)裂頭蚴的免疫逃避及其在宿主體內(nèi)的長(zhǎng)期寄生可能起著重要作用。
　　為了鑒定裂頭蚴河南不同地理株的蟲(chóng)種、研究其遺傳變異與系統(tǒng)發(fā)育地位，本文從河南省6個(gè)地區(qū)（開(kāi)封、鄭州、扶溝、新鄉(xiāng)、漯河、周口）自然感染的青蛙體內(nèi)分離裂頭蚴，經(jīng)口感染家貓后收集蟲(chóng)卵

3、與成蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，選取曼氏迭宮絳蟲(chóng)3個(gè)線粒體基因（cox1、cox3和nad4）作為分子標(biāo)記，對(duì)河南6個(gè)地區(qū)的裂頭蚴進(jìn)行了序列分析及遺傳變異分析。此外，本文還應(yīng)用基因工程技術(shù)對(duì)裂頭蚴抗原多肽基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)，將純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠獲得重組蛋白免疫血清，應(yīng)用Westernblotting及間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）發(fā)現(xiàn)裂頭蚴抗原多肽在曼氏迭宮絳蟲(chóng)不同發(fā)育期的表達(dá)及其在蟲(chóng)體組織的定位，并將其用于裂頭蚴感染小鼠血清的特

4、異性抗體的檢測(cè)，對(duì)裂頭蚴病的檢測(cè)提供新的候選抗原。
　　材料與方法:
　　1.裂頭蚴的采集與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染:從河南省漯河、開(kāi)封、鄭州、新鄉(xiāng)、通許、扶溝六地區(qū)自然感染青蛙體內(nèi)分離裂頭蚴。將六地區(qū)分離出的裂頭蚴經(jīng)口感染6只3月齡的無(wú)病原體家貓（10條/只），在感染后8～25天當(dāng)中，每天使用自然沉淀法收集貓糞便中的蟲(chóng)卵在顯微鏡下進(jìn)行鑒定，感染后4周將貓剖殺，從貓小腸內(nèi)收集成蟲(chóng)并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。
　　2.幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)目的基因的擴(kuò)增

5、及序列分析:對(duì)曼氏迭宮絳蟲(chóng)cox1、cox3和nad4三個(gè)線粒體基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將純化后的PCR產(chǎn)物送北京金唯智生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序。首先使用Clustal X v2.0中的默認(rèn)參數(shù)設(shè)置對(duì)3個(gè)基因序列進(jìn)行比對(duì)然后在Se-Alv2.0a11中對(duì)比對(duì)序列進(jìn)行校正。使用MEGA v5.0軟件進(jìn)行遺傳距離分析。
　　3.系統(tǒng)發(fā)育分析:最后分別利用PAUP*4b10、PhyML v3.0和MrBayes v3.1軟件對(duì)cox1+cox3

6、+pnad4三基因聯(lián)合序列進(jìn)行最大簡(jiǎn)約法(MP)、最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)分析，并繪制曼氏迭宮絳蟲(chóng)河南省6個(gè)地區(qū)分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
　　4.裂頭蚴抗原多肽基因的克隆與表達(dá):合成裂頭蚴抗原多肽基因，并在序列兩端添加酶切位點(diǎn)5' BamHⅠ和3'HindⅢ，保證在裂頭蚴抗原多肽基因序列中僅有BamHⅠ和HindⅢ2個(gè)酶切位點(diǎn)。將多肽基因克隆至載體pUC57-Kan。將目的基因雙酶切后亞克隆至表達(dá)載體pMAL-c2X，構(gòu)建

7、重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21，對(duì)重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果正確后用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體沉淀經(jīng)超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE，觀察是否有抗原多肽蛋白的表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行可溶性分析。
　　5.裂頭蚴抗原多肽重組蛋白的鑒定:應(yīng)用Amylose樹(shù)脂預(yù)裝柱對(duì)表達(dá)的裂頭蚴抗原多肽重組蛋白進(jìn)行親和層析純化，將純化后的

8、重組蛋白免疫BALB/c小鼠，獲得重組蛋白免疫血清，通過(guò)Western blotting應(yīng)用重組蛋白免疫血清對(duì)重組蛋白、裂頭蚴可溶性抗原及ES抗原進(jìn)行識(shí)別。
　　將從自然感染蛙體與實(shí)驗(yàn)感染鼠體內(nèi)分離的裂頭蚴以及貓?bào)w內(nèi)收集的成蟲(chóng)進(jìn)行石臘切片，應(yīng)用IFA檢測(cè)裂頭蚴抗原多肽在曼氏迭宮絳蟲(chóng)不同發(fā)育期蟲(chóng)體的表達(dá)及其在蟲(chóng)體組織的定位。應(yīng)用重組蛋白與裂頭蚴ES蛋白分別用于檢測(cè)裂頭蚴感染小鼠及其他寄生蟲(chóng)感染小鼠血清，觀察SAP-ELISA診斷裂頭

9、蚴病的敏感性與特異性。
　　結(jié)果:
　　1.蟲(chóng)卵與成蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定:裂頭蚴經(jīng)口感染貓后11天，在貓糞便中發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)卵;感染后4周從每只貓的小腸內(nèi)檢出10條26～45厘米長(zhǎng)的成蟲(chóng)。蟲(chóng)卵卵殼較薄、淺灰褐色、呈橢圓形，52～76微米長(zhǎng)、31～44微米寬，且兩端稍尖、一端有卵蓋，內(nèi)有一個(gè)卵細(xì)胞和若干個(gè)卵黃細(xì)胞。基于如下形態(tài)特征將收集的成蟲(chóng)鑒定為曼氏迭宮絳蟲(chóng):頭節(jié)背、腹面各有一條縱行的吸槽，成節(jié)和孕節(jié)結(jié)構(gòu)基本相似，肉眼可見(jiàn)每個(gè)節(jié)片中部凸起

10、的子宮。并且在節(jié)片中部依次有雄性生殖孔、雌性生殖孔和子宮孔三個(gè)開(kāi)口。
　　2.裂頭蚴河南不同地理株的遺傳變異分析:鄭州、開(kāi)封、通許、扶溝、新鄉(xiāng)、漯河6地區(qū)收集的裂頭蚴及其成蟲(chóng)的cox1，cox3和nad4基因片段，均被成功擴(kuò)增，其序列長(zhǎng)度分別為417、390和578bp，且成蟲(chóng)與幼蟲(chóng)序列大小完全一致。cox1，cox3和nad4基因片段均富含AT堿基(AT含量分別為63.5％，68.3％和67％)，其序列變化范圍分別為0-4.4％

11、、0-0.8％和0-0.5％。
　　3.裂頭蚴河南不同地理株的系統(tǒng)發(fā)育分析:cox1，cox3和nad4序列的最適進(jìn)化模型分別為T(mén)N93+I、HKY+G和HKY+I。對(duì)cox1+cox3+pnad4聯(lián)合序列分別采用最大簡(jiǎn)約法、最大似然法和貝葉斯法的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，河南6個(gè)地區(qū)的裂頭蚴分離株與其他迭宮屬（Spirometra）絳蟲(chóng)一起形成一個(gè)具有高支持值的單系分支（其自展值和后驗(yàn)概率值分別為100、99和1.0），并與裂頭屬（

12、Diphyllobothrium）絳蟲(chóng)分支互為姊妹類(lèi)群。
　　4.裂頭蚴抗原多肽基因的克隆與表達(dá):對(duì)重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP進(jìn)行酶切鑒定，電泳后出現(xiàn)2條帶，1條帶為線性的pMAL-c2X(大小為6646 bp);另1條為783bp，與裂頭蚴抗原多肽的理論值大小相同，表明重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP構(gòu)建成功。對(duì)重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在68.7 kDa處出現(xiàn)一條明顯的

13、蛋白帶(載體融合蛋白40 kDa+目的蛋白28.7 kDa)，表明重組蛋白表達(dá)成功，可溶性分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白以可溶形式表達(dá)。
　　5.裂頭蚴抗原多肽重組蛋白的鑒定:Western blotting結(jié)果顯示，裂頭蚴抗原多肽重組蛋白可被裂頭蚴感染小鼠血清所識(shí)別;重組蛋白免疫血清可識(shí)別裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原，在28.7kDa處有1條蛋白帶，表明裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原均存在。IFA結(jié)果顯示，重組蛋白免疫血清與蛙體與鼠

14、體內(nèi)的裂頭蚴均呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，蟲(chóng)體皮層及內(nèi)部組織均呈黃綠色熒光，但與成蟲(chóng)則為陰性反應(yīng)，蟲(chóng)體呈橘紅色，表明裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴期表達(dá)，在成蟲(chóng)期則不表達(dá)。SAP-ELISA和ES-ELISA檢測(cè)裂頭蚴感染小鼠血清抗體陽(yáng)性率分別為83.8％(25/30)和100％(30/30)，SAP-ELISA的陽(yáng)性率低于ES-ELISA(P＜0.05)。檢測(cè)弓形蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)感染小鼠血清和正常小鼠血清均為陰性。
　　結(jié)論:
　　1.經(jīng)形態(tài)

15、學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，河南6個(gè)地區(qū)的裂頭蚴分離株均屬于曼氏迭宮絳蟲(chóng)，cox1，cox3和nad4基因均能很好地揭示裂頭蚴各地理株線粒體之間的遺傳變異，且cox1的變異程度最高，cox3次之而nad4的變異程度最低。
　　2.成功構(gòu)建了裂頭蚴抗原多肽的表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP，重組蛋白以可溶形式表達(dá)。Western blotting與IFA結(jié)果表明，裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴期表達(dá)，在裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原均存在，定位于蟲(chóng)體皮