不同地理株柔嫩艾美耳球蟲雜交蟲株F2的培育及體外培養(yǎng)技術(shù)的建立.pdf

1、雞球蟲病是危害現(xiàn)代化養(yǎng)雞業(yè)的重大疫病之一。多年來眾多科學(xué)家對本病進行了大量的研究工作。先后研制出大量抗球蟲藥物，并應(yīng)用于臨床實踐。但由于耐藥蟲株的出現(xiàn)及殘留藥物對人體的危害，使藥物防治受到限制。免疫預(yù)防已成為當(dāng)前研究的熱點，就目前的研究看：球蟲的免疫機制尚未完全闡明，不同種株球蟲共有的保護性抗原尚未得到，已有的疫苗不能對所有種或同一種不同株的球蟲產(chǎn)生完全保護性免疫。國外的研究者已利用單卵囊雜交技術(shù)培育雜交蟲株，并獲得雜交親本株的遺傳標(biāo)記

2、：如共同抗原等。這方面的報道在耐藥蟲株的研究中較多。本研究將來自不同地域的野毒株柔嫩艾美耳球蟲(甘肅株、北京株、吉林株)，采用單孢子囊接種技術(shù)培育各株單孢子囊后代，利用RAPD技術(shù)進行多態(tài)性分析，培育出雜交株F2，且在RAPD中出現(xiàn)了特有條帶，并將F2進行體外培養(yǎng)。具體內(nèi)容如下： 雜交親本株的選擇：用五個不同地理株Eimeria.tenella，即：黑龍江株、山東株、吉林株、北京株、甘肅株，對10日齡雛雞分別進行免疫攻蟲，通過O

3、PG計數(shù)，糞便計分，盲腸病變計分，增重測定，計算保護率，選擇了免疫原性好且具有較強免疫保護力的甘肅株、北京株、吉林株。 RAPD分析方法的建立：應(yīng)用RAPD(隨機引物擴增多態(tài)性DNA)技術(shù)，對三個雜交親本株甘肅株、北京株、吉林株及它們的子代蟲株進行了分析(14條隨機引物)。在RAPD分析過程中，發(fā)現(xiàn)甘肅株、北京株、吉林株之間存在差異，相似值為0.6022～0.6971，平均為0.6497。各親本株與子代株也存在差異，相似值為0.

4、9838～0.9913，平均值為0.9876。根據(jù)相似值，列出了相似性矩陣，并繪制了親緣關(guān)系樹狀圖，從而建立了應(yīng)用RAPD技術(shù)鑒定不同地理株柔嫩艾美耳球蟲的方法。 雜交蟲株的培育：利用雜交技術(shù)對甘肅株、吉林株、北京株進行了雜交，通過單孢子囊技術(shù)分離雜交后代，并進行單孢子囊擴增。依據(jù)建立的RAPD分析方法，對13個甘肅株與吉林株雜交后代的單孢子囊擴增產(chǎn)物進行了分析，在分析中發(fā)現(xiàn)有一個單孢子囊擴增產(chǎn)物的RAPD譜帶與其它不同，且其與

5、兩親本株和子代株的相似性也與其它蟲株不同，即：此蟲株與兩親本株間的相似值為0.7598～0.8813，遠遠小于子代株與親本株平均相似值0.9876，又遠遠大于株間相似值的平均值0.6497。依據(jù)親緣關(guān)系樹狀圖，確定該蟲株為甘肅株與北京株的雜交蟲株(雜交一代，F(xiàn)1)。獲得的雜交F1進一步與北京株進行雜交(雜交二代，F(xiàn)2)，并用RAPD方法對13個雜交后代單孢子囊擴增產(chǎn)物進行分析，找到了一株與親本株相似性為0.7658～0.8831的蟲株，

6、依據(jù)親緣關(guān)系樹狀圖，確定其為雜交F2株。體外培養(yǎng)的建立：將雜交株F2接種于10-12日齡的雞胚尿囊腔，經(jīng)過連續(xù)加大劑量和增加接種胚數(shù)的方法，促使球蟲逐漸適應(yīng)雞胚，最后直線傳至第9代，球蟲已適應(yīng)雞胚，接種劑量由每胚4萬條子孢子降至1萬條，一直傳至22代，建立起F2株的雞胚適應(yīng)株。 本研究利用雜交技術(shù)，將不同地理株的柔嫩艾美耳球蟲混合感染雛雞，雞體內(nèi)配子發(fā)生隨機交配，將獲得等量的母型和雜交型合子，收集所產(chǎn)生的卵囊，通過RAPD技術(shù)鑒