杜仲M(fèi)EP途徑系列基因全長(zhǎng)cDNA分離鑒定及序列特征研究.pdf

1、杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是我國(guó)特有的第三紀(jì)孑遺植物，也是優(yōu)良的溫帶膠源樹(shù)種和名貴藥用樹(shù)種。杜仲萜類化合物廣泛應(yīng)用于人們生產(chǎn)生活，其中最為重要的是杜仲膠和環(huán)烯醚萜類。2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑是植物萜類生物合成上游重要的調(diào)控路徑之一。本研究以杜仲葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分離鑒定MEP途徑所有相關(guān)酶高表達(dá)水平基因的cDN

2、A全長(zhǎng)，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)序列特征、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及基因功能進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，旨為潛在功能基因的篩選和挖掘，合成途徑中限速步驟的深入探究以及為萜類代謝工程靶點(diǎn)的確定和基因改良育種提供基礎(chǔ)信息。
　　1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS是MEP途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，在杜仲中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)DXS酶基因家族成員，分別命名為EuDXS1和EuDXS2。EuDXS1基因cDNA全長(zhǎng)2805 bp，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)218 bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)4

3、48 bp，編碼712個(gè)氨基酸，與美麗帽柱木DXS基因序列相似性最高，達(dá)81％；EuDXS2基因cDNA全長(zhǎng)2552 bp，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)73 bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)337 bp，編碼713個(gè)氨基酸，與橡膠DXS基因序列相似性最高，達(dá)82%。推導(dǎo)EuDXS1與EuDXS2氨基酸序列中均包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（A1-A18；A1-A34）、TPP結(jié)合基序（A106-A360；A108-A362）、嘧啶結(jié)合基序（A397-A553；A399-A5

4、55）和轉(zhuǎn)酮醇酶C末端基序（A571- A676；A573-A678）等植物DXS蛋白典型的保守基序與功能位點(diǎn)。推導(dǎo) EuDXS1與EuDXS2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均以螺環(huán)結(jié)構(gòu)為主，分別占48.74%和49.37%。推導(dǎo)EuDXS1和EuDXS2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分別由兩個(gè)亞單位組成。EuDXS1蛋白與蓖麻DXS1蛋白親緣關(guān)系最為接近，EuDXS2蛋白與橡膠DXS2蛋白親緣關(guān)系最為接近。
　　1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶DXR是ME

5、P途徑中的第二個(gè)限速酶，在杜仲中分離鑒定出兩個(gè)DXR酶基因家族成員，分別命名為EuDXR1和EuDXR2。EuDXR1基因cDNA全長(zhǎng)1814 bp，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)126 bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)251 bp，編碼478個(gè)氨基酸，與毛果楊DXR基因序列的相似性最高，達(dá)81%；EuDXR2基因cDNA全長(zhǎng)1779 bp，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)163 bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)251 bp，編碼472個(gè)氨基酸，與葡萄DXR基因序列的相似性最高，達(dá)81

6、%。推導(dǎo)EuDXR1與EuDXR2氨基酸序列中均包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（A1-A51；A1-A43），具有2個(gè)DXR蛋白結(jié)合基序（A227-A236，A297-A307；A221-A230，A291- A301），2個(gè)NADPH結(jié)合基序（A88-A94，A113-A119；A82-A88，A107-A113）以及N端富脯氨酸基序（A61-A69；A55-A63）等植物 DXR蛋白典型的保守基序與功能位點(diǎn)。推導(dǎo)EuDXR1與EuDXR2蛋白二級(jí)結(jié)

7、構(gòu)均以螺環(huán)結(jié)構(gòu)為主，分別占47.91%和45.34%。推導(dǎo)EuDXR1和 EuDXR2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分別由兩個(gè)亞單位組成，在空間上呈“V”字結(jié)構(gòu)。EuDXR1蛋白與水稻DXR1蛋白親緣關(guān)系最為接近，EuDXR2蛋白與玉米DXR2蛋白親緣關(guān)系最為接近。
　　2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶MCT催化MEP途徑的第三步酶促反應(yīng)，在杜仲中分離出一個(gè)MCT酶基因，命名為EuMCT。EuMCT基因cDNA全長(zhǎng)1435 bp，5’端非

8、編碼區(qū)長(zhǎng)223 bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)252 bp，編碼319個(gè)氨基酸，與葡萄MCT基因序列相似性最高，達(dá)82%。推導(dǎo) EuMCT氨基酸序列中包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（A1-A75）以及植物MCT蛋白多個(gè)保守的功能位點(diǎn)（A100，A102，A103，A104，A105，A106，A114，A170，A171，A173，A176，A195，A196，A198，A228，A244，A250，A252，A300）。EuMCT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占23

9、.82%，β-折疊占18.18%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占57.99%。EuMCT蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)由兩個(gè)亞單位組成，并且存在兩個(gè)特殊的P-loop結(jié)構(gòu)。EuMCT蛋白與葡萄MCT蛋白親緣關(guān)系最為接近。
　　4-（5’-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶CMK催化MEP途徑的羥基磷酸化反應(yīng)，在杜仲中分離出一個(gè)CMK酶基因，命名為EuCMK。EuCMK基因cDNA全長(zhǎng)1644 bp，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)256 bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)203 bp，編

10、碼394個(gè)氨基酸，與番茄CMK基因序列相似性最高，達(dá)82%。EuCMK氨基酸序列中包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（A1-A57）以及植物CMK蛋白催化過(guò)程中所必需的ATP結(jié)合位點(diǎn)（A186-A202）。推導(dǎo)EuCMK結(jié)構(gòu)α-螺旋占32.74%，β-折疊占19.29%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占47.97%。推導(dǎo)EuCMK蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)由兩個(gè)不對(duì)稱的亞基組成。EuCMK蛋白與葡萄CMK蛋白親緣關(guān)系最為接近。
　　2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸合酶MDS催化M

11、EP途徑的第五步酶促反應(yīng)，在杜仲中分離出一個(gè)MDS酶基因，命名為EuMDS。EuMDS基因cDNA全長(zhǎng)976 bp，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)119 bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)146 bp，編碼236個(gè)氨基酸，與紫莖澤蘭MDS基因序列相似性最高，達(dá)79%。EuMDS氨基酸序列中包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（A1-A56）以及多個(gè)植物MDS蛋白保守的功能位點(diǎn)（A84，A87，A89，A121，A213，A217，A221，A223，A228）。推導(dǎo)EuMDS蛋白二級(jí)

12、結(jié)構(gòu)中α-螺旋占40.25%，β-折疊占13.56%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占46.19%。推導(dǎo) EuMDS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)由三個(gè)亞單位組成，并相互圍繞形成一個(gè)分子內(nèi)腔。EuMDS蛋白與啤酒花MDS蛋白親緣關(guān)系最為接近。
　　1-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶HDS為MEP途徑的第六個(gè)作用酶，在杜仲中分離出一個(gè)HDS酶基因，命名為EuHDS。EuHDS基因cDNA全長(zhǎng)2786 bp，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)171 bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)38

13、3 bp，編碼743個(gè)氨基酸，與葡萄HDS基因序列相似性最高，達(dá)84%。推導(dǎo) EuHDS氨基酸序列中包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（A1-A30）、PSN基序（A58-A78）、PSI基序（A354-A620）以及植物HDS蛋白3個(gè)絕對(duì)保守的半胱氨酸位點(diǎn)（A644，A647，A678）。推導(dǎo)EuHDS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋占37.55%，β-折疊占19.25%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占43.20%。推導(dǎo)EuHDS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)N端為一個(gè)屬TIM-barrel超家族的八鏈

14、β桶形結(jié)構(gòu)，C端為一個(gè)兩側(cè)翼為螺旋結(jié)構(gòu)的β折疊構(gòu)造。EuHDS蛋白與葡萄HDS蛋白的親緣關(guān)系最為接近。
　　1-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶HDR是MEP途徑中的第三個(gè)關(guān)鍵酶，在杜仲中分離出一個(gè)HDR酶基因，命名為EuHDR。EuHDR基因cDNA全長(zhǎng)1653 bp，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)82 bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)188 bp，編碼460個(gè)氨基酸，與喜樹(shù)HDR基因序列相似性最高，達(dá)82%。推導(dǎo) EuHDR氨基酸序列

15、中包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（A1-A33）以及植物HDR蛋白多個(gè)保守的功能位點(diǎn)（A117，A208，A262，A345）。推導(dǎo)EuHDR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋占35.65%，β-折疊占19.78%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占44.57%。推導(dǎo)EuHDR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)為單體形式，呈不規(guī)則的三葉草形狀。EuHDR蛋白與葡萄HDR蛋白的親緣關(guān)系最為接近。
　　異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶IPI催化IPP與DMAPP之間的可逆轉(zhuǎn)化，是萜類代謝網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)樞紐，在杜仲中分離出一個(gè)

16、IPI酶基因，命名為EuIPI。EuIPI基因cDNA全長(zhǎng)1231 bp，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)79 bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)231 bp，編碼306個(gè)氨基酸，與喜樹(shù)IPI基因序列相似性最高，達(dá)84%。推導(dǎo)EuIPI氨基酸序列包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（A1-A70）以及植物IPI蛋白典型的功能位點(diǎn)（A154、A175，A107、A119、A156、A196、A206、A208）。推導(dǎo)EuIPI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋占22.55%，β-折疊占13.40%，螺