ROCK-Ⅰ在大鼠肝纖維化形成和肝星狀細(xì)胞遷移過(guò)程中作用機(jī)制的研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝硬化的共同病理基礎(chǔ)和必經(jīng)階段，是影響慢性肝病的重要環(huán)節(jié)，因此肝纖維化的預(yù)防、治療乃至逆轉(zhuǎn)是阻斷肝硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝纖維化也成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究慢性肝病的焦點(diǎn)。我國(guó)是肝病高發(fā)國(guó)家，以慢性乙型、丙型病毒性肝炎最為常見(jiàn)，在目前尚無(wú)良好的抗病毒藥物的情況下，阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程成為治療慢性肝病的重要對(duì)策。 肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝纖維化形成過(guò)

2、程中的關(guān)鍵細(xì)胞成分，是肝內(nèi)細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要細(xì)胞來(lái)源，因此抑制HSCs活化與增殖則成為阻止并逆轉(zhuǎn)肝纖維化的主要途徑之一。 細(xì)胞遷移是機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育以及組織損傷、修復(fù)和炎癥反應(yīng)必不可缺的病理生理過(guò)程，在肝組織修復(fù)及肝纖維化形成過(guò)程中，損傷局部大量HSCs聚集可能與HSCs定向遷移有關(guān)。細(xì)胞遷移涉及到細(xì)胞骨架、細(xì)胞黏附相關(guān)的動(dòng)態(tài)組裝和空間位置的變化。從細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)研究結(jié)果來(lái)看，細(xì)

3、胞黏附、鋪展和遷移是一復(fù)雜且尚未完全闡明的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控的病理生理過(guò)程。 近年來(lái)，Rho/ROCK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種器官組織慢性炎性纖維化中的作用受到了日益廣泛的關(guān)注。有研究表明，選擇性阻斷該信號(hào)通路可以改善纖維化器官的進(jìn)展和預(yù)后，但其在肝纖維化進(jìn)程中的作用機(jī)制目前尚不清楚。目前，該信號(hào)通路選擇性抑制劑國(guó)內(nèi)外均能生產(chǎn)，如該研究達(dá)到預(yù)期效果，將為肝纖維化的治療提供一種新的選擇。 為此，我們從HSCs遷移著手，以R

4、OCK-I、磷酸化肌球蛋白結(jié)合亞單位(myosin binding subunit，MBS Thr-697)、α-SMA 為切入點(diǎn)，有機(jī)結(jié)合整體和離體實(shí)驗(yàn)，研究了Rho/RDCK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化形成和大鼠HSCs 遷移過(guò)程中的作用。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下3部分： 第一部分：大鼠肝纖維化組織ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA的動(dòng)態(tài)表達(dá) 目的：探討ROCK-I、磷酸化MBS Th

5、r-697、α-SMA 蛋白及其mRNA在實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化形成過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化。 方法：采用膽總管結(jié)扎(bile duct ligation，BDL)方法制備大鼠肝纖維化模型，將80只雄性Sprague Dawley 大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組和模型組。模型組分別于結(jié)扎后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動(dòng)物，假手術(shù)組與4wk模型組同批麻醉。采用HE 及Masson三色染色確定模型建立情況；免疫組織化學(xué)、We

6、stern blot 與RT-PCR 方法研究ROCK-I、α-SMA 蛋白及其mRNA 在肝纖維化不同時(shí)期肝組織中的分布及含量的動(dòng)態(tài)變化；采用Western blot 方法檢測(cè)ROCK-I底物—肌球蛋白磷酸酶結(jié)合亞單位第697位蘇氨酸(MBSThr-697)，的磷酸化水平，作為Rho/ROCK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化指標(biāo)；采用特異性熒光染色方法檢測(cè)肝纖維化不同時(shí)期肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化。 結(jié)果：①隨著肝纖維化的發(fā)展，大鼠肝臟中ROC

7、K-I、α-SMA 陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，主要分布在匯管區(qū)、纖維間隔及增生的膽管周?chē)?xì)胞，造模1～4wk 大鼠肝組織ROCK-I(14.71％±4.01％、20.66％±2.34％、26.21％±1.74％、32.50％±2.55％)、α-SMA(13.62％±1.48％、23.25％±2.02％、27.92％±1.61％、33.69％±1.999％)的陽(yáng)性面積顯著性高于正常組(5.35％±1.30％、6.22％±1.56％)，P<0.05

8、。②Westerrl blot 結(jié)果顯示，正常大鼠ROCK-I 蛋白表達(dá)水平較低，在肝纖維化發(fā)生早期即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，至病變后期仍維持較高水平，模型組1～4wk 其表達(dá)分別較正常對(duì)照組增加0.83倍、1.14倍、1.96倍、2.33 倍，假手術(shù)組與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異，P>0.05；磷酸化MBS Thr-697蛋白模型組1～4wk分別較正常對(duì)照組增加0.80倍、1.37倍、2.29倍和3.34倍，假手術(shù)組與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異，P>0.0

9、5；α-SMA 蛋白模型組1～4wk分別較正常對(duì)照組增加0.48倍、0.87倍、1.49倍和2.10倍，假手術(shù)組與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異，P>0.05。③RT-PCR 結(jié)果顯示，正常大鼠肝組織中有α-SMA基因表達(dá)，模型組第2天(264.69±30.28)即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，至第21天(817.33±67.60)達(dá)高峰后有所下降，至模型后期(801.67±78.50)仍高于基礎(chǔ)表達(dá)(245.33±27.16)。ROCK-I電泳條帶的光密度掃描

10、顯示，正常大鼠肝組織中就有ROCK-I基因表達(dá)，在纖維化發(fā)生早期即出現(xiàn)明顯上調(diào)，至第14天(722.67±86.08)達(dá)高峰而后下降，至病變后期(第28天)(707.00±82.79)仍高于基礎(chǔ)表達(dá)(276.33±37.45)，并且與0c—SMlA表達(dá)呈顯著性正相關(guān)(r=0.718，P<0.05)。④用FITC 標(biāo)記的鬼筆毒環(huán)肽熒光染色，激光共聚焦掃描顯微鏡觀(guān)察，正常大鼠肝臟F-actin位于細(xì)胞周邊，可見(jiàn)少量肌動(dòng)蛋白絲，隨著造模時(shí)間延

11、長(zhǎng)，肝組織熒光信號(hào)增強(qiáng)。 結(jié)論：肝纖維化形成過(guò)程中，ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697和α-SMA表達(dá)明顯增加，提示ROCK-I 在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中不但有表達(dá)上調(diào)，而且有功能活化；ROCK-I mRNA 表達(dá)水平較α-SMA 提前達(dá)峰值，提示ROCK-I 可能通過(guò)誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞表型形成而參與肝纖維化的發(fā)生；肝纖維化形成過(guò)程中，隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，可見(jiàn)大鼠肝組織特異性熒光信號(hào)增強(qiáng)，細(xì)胞間規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，提示肝纖維化時(shí)肌

12、動(dòng)蛋白大量增生，同時(shí)發(fā)生細(xì)胞骨架重組。 第二部分：ROCK-I抑制劑Y-27632 抑制大鼠肝星狀細(xì)胞黏附與遷移 目的：觀(guān)察Rho/ROCK 信號(hào)通路特異性阻斷劑Y-27632對(duì)大鼠HSCsROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA表達(dá)及HSCs 黏附、遷移和細(xì)胞骨架的影響，探討該信號(hào)通路在HSCs 黏附、遷移過(guò)程中的作用。 方法：應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，采用MTT法測(cè)定HSCs 增殖；甲苯胺藍(lán)染色法測(cè)

13、定HSCs 黏附率；Boyden小室跨膜遷移分析法測(cè)定HSCs遷移；FITC標(biāo)記鬼筆毒環(huán)肽測(cè)定HSCs 細(xì)胞骨架變化；Western blot 測(cè)定ROCK-I底物—磷酸化MBS Thr-697蛋白表達(dá)，作為Rho/ROCK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化指標(biāo)；采用RT-PCR．方法研究ROCK-I、α-SMA mRNA在HSCs不同干預(yù)組的變化。 結(jié)論：體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，ROCK-I特異性抑制劑Y-27632 可以抑制LPA誘導(dǎo)的HSC

14、s增殖、黏附和遷移，在一定濃度范圍內(nèi)，呈明顯的劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性；Y-27632可以抑制HSCs ROCK-I、α-SMA和p-MBS Thr-697的表達(dá)；特異性熒光檢測(cè)F-actin研究表明，ROCK-I特異性抑制劑Y-27632可部分預(yù)防和逆轉(zhuǎn)LPA誘導(dǎo)的HSCs骨架重組。 第三部分：法舒地爾對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化組織及肝星狀細(xì)胞遷移的抑制作用 目的：觀(guān)察ROCK-I 選擇性阻斷劑法舒地爾對(duì)大鼠肝纖維化組織ROC

15、K-I、α-SMA、磷酸化MBS Thr-697表達(dá)及HSCs 黏附、遷移和細(xì)胞骨架的影響。 方法：從動(dòng)物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩方面，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定肝組織ROCK-I、α-SMA表達(dá)；Western blot方法測(cè)定肝組織和HSCs ROCK-I、α-SMA、磷酸化MBS-Thr697表達(dá)；RT-PCR 方法測(cè)定肝組織和HSCsROCK-I、α-SMA mRNA表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定HSCs ROCK-I、α-SMA表達(dá)；特異性

16、熒光染色檢測(cè)細(xì)胞骨架變化。 結(jié)論：ROCK-I 選擇性阻斷劑法舒地爾可抑制BDL大鼠模型肝組織ROCK-I、p-MBSThr-697、α-SMA 轉(zhuǎn)錄及翻譯水平表達(dá)；體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，阻斷劑法舒地爾可抑制LPA誘導(dǎo)的HSCs黏附和遷移，在一定濃度范圍內(nèi)呈明顯的時(shí)間依賴(lài)性，同時(shí)法舒地爾可抑制LPA誘導(dǎo)的HSCs表達(dá)ROCK-I、p-MBSThr-697、α-SMA；特異性熒光檢測(cè)F-actin研究表明，法舒地爾可部分抑制BDL