血瘀相關(guān)因素在肝纖維化形成中的作用與機(jī)制.pdf

1、背景及目的:肝硬化是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病,由不可逆性肝纖維化發(fā)展而來,預(yù)后差。中醫(yī)從血瘀病機(jī)出發(fā)常用活血化瘀藥物治療肝纖維化、肝硬化,臨床療效顯著。中醫(yī)血瘀與西醫(yī)淤血微循環(huán)障礙有病理學(xué)交叉之處,近年來研究發(fā)現(xiàn)肝臟微循環(huán)障礙為肝纖維化主要發(fā)病機(jī)制和病理基礎(chǔ)之一,但基于中醫(yī)血瘀的肝纖維化形成機(jī)制研究還不夠清晰,因此我們擬建立一種能夠去除其他致病因素干擾,獨(dú)立體現(xiàn)血瘀致肝纖維化這一病理過程的動(dòng)物模型,嘗試觀察血瘀致肝纖維化的形成特點(diǎn),分

2、析可能的發(fā)病機(jī)理,單純探索血瘀與肝纖維化之間的關(guān)系,尋找活血化瘀中藥防治肝纖維化作用的關(guān)鍵靶點(diǎn),為防治肝纖維化、肝硬化中藥新藥物篩選提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)及參考。
　　方法:(1)采用經(jīng)肝后段下腔靜脈部分結(jié)扎術(shù)(partial ligation of the suprahepatic inferior vena cava,pIVCL)制作慢性瘀血性肝纖維化小鼠模型,部分小鼠無(wú)特殊處理措施常規(guī)喂養(yǎng),部分小鼠給予抗凝劑華法林口服,部分采用組織

3、旁路因子抑制劑(Tissue factor pathway inhibitor,TFPI)轉(zhuǎn)基因小鼠制作模型。于術(shù)后6周處死小鼠。(2)記錄小鼠體重及肝脾重量,門靜脈壓力等一般情況,收集血清、肝臟或細(xì)胞樣本,分別進(jìn)行肝功能檢測(cè)、組織學(xué)檢查(蘇木精-伊紅染色、天狼猩紅染色),羥脯氨酸含量檢測(cè)、免疫熒光染色、RT-PCR、Western Blot、ELISA以及脫氧膽酸溶解性分析實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè),觀察評(píng)估血瘀致肝纖維化后,肝纖維化相關(guān)指標(biāo)平滑

4、肌肌動(dòng)蛋白(Smooth muscle acetinα,α-SMA)、膠原、纖維連接蛋白、纖維蛋白、羥脯氨酸等變化,行磁共振掃描評(píng)估肝硬變程度及其與門靜脈壓力、肝內(nèi)羥脯氨酸含量關(guān)系分析。(3)以人或小鼠肝星形細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)為目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),評(píng)估細(xì)胞受到周期性機(jī)械拉伸、細(xì)胞周圍纖維蛋白含量變化、應(yīng)用β1整合素受體或肌動(dòng)蛋白抑制劑對(duì)HSC分泌纖維連接蛋白及溶解性的影響。
　　結(jié)果:①本

5、研究采用肝后段下腔靜脈部分結(jié)扎術(shù)(pIVCL)成功建立了瘀血性肝纖維化小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?描述了模型小鼠肝/體重量比、脾/體重量比、門靜脈壓力、肝功等一般情況。②體內(nèi)試驗(yàn):pIVCL手術(shù)組6周時(shí)膠原沉積、肝內(nèi)羥脯氨酸含量、α-SMA較假手術(shù)組均顯著增加;術(shù)后口服抗血凝劑華法林6周或采用TFPI轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行pIVCL術(shù)后,膠原沉積、肝內(nèi)羥脯氨酸含量、α-SMA表達(dá)較野生型小鼠pIVCL術(shù)后增加幅度顯著減少;pIVCL手術(shù)后小鼠肝臟 MRE提示

6、肝硬度增加,與門靜脈壓力升高及肝內(nèi)羥脯氨酸含量增加成正比。③體外實(shí)驗(yàn):HSC受到周期性機(jī)械拉伸、予纖維蛋白刺激,則纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)產(chǎn)量增加,不可溶性FN增加;給予β1整合素受體或肌動(dòng)蛋白抑制劑刺激則使HSC分泌FN減少,不可溶性FN含量減少;在纖維蛋白膠內(nèi)孵育HSC,MRE檢測(cè)結(jié)果示纖維蛋白膠硬度增加。
　　結(jié)論:①通過瘀血性肝纖維化小鼠模型的建立,證實(shí)血瘀可以作為獨(dú)立致病因素導(dǎo)致肝纖維化產(chǎn)生;②該小鼠