氧化-抗氧化失衡在肺間質(zhì)纖維化形成及防治中的作用.pdf

1、間質(zhì)性肺疾病(ILD)是由200余種疾病組成的一類疾病，他們在臨床表現(xiàn)、實驗室和病理學改變上具有一定的共同特點，但又有各自不同的特征。肺纖維化的典型病理學過程為肺泡上皮損傷，炎性細胞聚集，成纖維細胞過度增殖，細胞外基質(zhì)沉積，成纖維細胞增殖灶，以及蜂窩肺的形成。 博萊霉素可導致嚙齒類動物急性肺損傷和肺纖維化，這一特點為研究肺間質(zhì)纖維化提供了成熟的動物模型。最近研究表明，氧化/抗氧化失衡(即氧化應激)可誘導轉(zhuǎn)錄因子核因子-кB(NF

2、-кB)的活化，具體機制尚不清楚。NF-кB是重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)許多炎癥性細胞因子的轉(zhuǎn)錄，P65是其重要的功能亞單位。先前的研究顯示，在BLM誘導的肺間質(zhì)纖維化病理過程中，NF-кB的表達明顯增強。本研究旨在探討NF-кB的活化與氧化/抗氧化失衡的關系及其在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機制中的作用，并進一步研究抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)治療肺間質(zhì)纖維化的作用機制。 材料與方法 一、實驗材料 1、實驗動物 8

3、周齡雌性C57BL/6小鼠體重17-20g，無特殊病原體SPF級(北京維通利華實驗動物技術公司)。 2、實驗藥品 10％水合氯醛，博萊霉素(天津太河制藥有限公司)，N-乙酰半胱氨酸(海南贊邦制藥有限公司)。 3、實驗試劑 NF-кBP65免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；P65 m-RNA原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；IL-4與TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上

4、海森雄科技實業(yè)有限公司)；羥脯氨酸(HYP)、谷胱甘肽(GSH)與丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。 4、實驗設備 紫外光、可見光連續(xù)分光光度計(法國S500-P)；全自動酶標儀(奧地利TECAN)；超聲勻漿機(德國UPH-200)。 二、實驗動物模型的建立、分組與標本處理 三、肺組織常規(guī)病理分析 1、常規(guī)病理肺組織經(jīng)不同濃度酒精常規(guī)脫水，制成5μm的肺組織石蠟切片，行HE染色

5、與Masson染色。 2、肺泡炎癥及纖維化程度的組織病理學評分方法依照Szapiel法確定肺泡炎癥及纖維化的程度，兩者均分4級，分別記為1、2、3、4分。 四、檢測指標及方法 1、樣本用堿水解法測定肺組織羥脯氨酸HYP含量。 2、比色法測定肺組織及BALF中MDA、GSH及蛋白含量。 3、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法測定BALF中IL-4與TGF-β1含量。 4、免疫組化染色與原位雜交染

6、色法分別測定支氣管肺泡灌洗細胞P65蛋白及其m-RNA的表達。 5、觀測小鼠的體重變化。 五、統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果 一、三組小鼠肺組織病理結(jié)果肺組織病理HE染色顯示，模型組小鼠經(jīng)氣管注射博來霉素后7天，肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)可見滲出改變，內(nèi)有炎癥細胞浸潤；14天時肺間質(zhì)大量炎癥細胞浸潤，

7、肺泡間隔明顯增厚，可見多發(fā)片狀實變，Masson三色染色可見肺間質(zhì)內(nèi)有明顯的膠原沉積；第28天肺組織可見大片的實變，其間可見大量的炎癥細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)明顯喪失， Masson三色染色可見肺間質(zhì)大量的膠原沉積，正常的肺泡結(jié)構(gòu)明顯喪失，形成明顯的纖維化改變。與模型組小鼠相比，NAC治療組小鼠第7天肺泡炎明顯減輕，肺泡間隔略有增厚，炎癥細胞浸潤較模型組明顯減輕；第28天可見肺實變程度較模型組明顯減輕，可見破壞的肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡間隔增厚明顯，間

8、質(zhì)內(nèi)可見大量炎癥細胞浸潤，有明顯膠原沉積。 二、三組小鼠肺泡炎癥及纖維化程度的病理學評分結(jié)果1、三組小鼠肺泡炎癥程度病理評分比較氣管注射博來霉素后7天與14天，BLM組小鼠肺泡炎癥評分為3.5±0.6與3.0±0.5，治療組小鼠肺泡炎癥評分為2.5±0.3與2.1±0.2，兩組間進行比較的結(jié)果顯示，NAC明顯減輕了BLM誘導的肺泡炎癥程度(P<0.01)2、三組小鼠肺組織纖維化程度病理評分比較氣管注射博來霉素后，隨著實驗時間的延

9、長，BLM組與治療組小鼠肺組織纖維化程度逐漸加重。在注射博來霉素后28天，BLM組小鼠肺組織纖維化評分結(jié)果為3.8±0.5，肺纖維化程度最明顯，與治療組(2.2±0.6)比較的結(jié)果顯示，NAC明顯減輕了BLM誘導的肺組織纖維化程度(P<0.01)。 三、HYP含量的比較模型組小鼠第28天時的肺組織HYP含量為(696.5±41.2μg/g)，與對照組(348.0±22.6μg/g)比較，增長了大約兩倍，兩者間有顯著的統(tǒng)計學差異(

10、P<0.01)。在注射博萊霉素后第7、14、28天，治療組HYP含量分別為450.6±27.1μg/g、520.3±22.8μg/g和575.6±23.4μg/g，雖分別較對照組明顯增加(P值分別為0.045，0.03和0.015)，但與相應時間的模型組(分別為495.4±23.6μg/g，595.4±37.8μg/g和696.5±41.2μg/g)比較，HYP含量分別顯著降低(P值分別為0.046，0.03和0.02)。這說明NAC明

11、顯減輕了BLM誘導的肺間質(zhì)纖維化程度。 四、MDA、GSH的含量 1、肺組織中GSH與MDA的含量(1)肺組織中GSH含量氣管注射BLM后7天，模型組小鼠肺組織GSH水平(86.2±10mg/gprot)與對照組(130.3±12mg/gprot)比較，明顯降低(P<0.01)，而治療組小鼠肺組織GSH水平為135.2±15mg/gprot明顯高于模型組，兩組間有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05)；28天時模型組小鼠肺組織

12、GSH含量仍低于正常對照組，但兩者間無顯著性差異。 (2)肺組織中MDA含量氣管注射BLM后，模型組小鼠肺組織MDA水平逐漸升高，7天時達峰值，為2.73±0.41 nmol/mgprot，與對照組(1.1±0.2nmol/mgprot)比較有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)；而7天時治療組小鼠肺組織MDA含量為1.91±0.36nmol/mgprot，較模型組下降，兩者間有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05)；14天和28天時兩組MDA水

13、平均逐漸下降并接近正常。 2、BALF中MDA與GSH的含量 五、支氣管肺泡灌洗細胞P65免疫組化染色與P65 m-RNA原位雜交染色結(jié)果 六、MDA、6SH與P65的相關分析 七、BALF中IL-4與TGF-β1的含量 八、三組小鼠的體重變化模型組與治療組小鼠的體重從氣管注射博萊霉素后第3天開始明顯下降，7天時下降最明顯，以后體重逐漸增加，而對照組小鼠體重在實驗期間一直增加。在氣管注射博萊霉素第

14、7、14、28天，模型組小鼠體重分別為15.7±0.29g、17.5±0.5g和20.2±0.29g，治療組小鼠體重分別為17.5±0.5g、19.7±0.29g和22.5±0.5g，對照組小鼠體重分別為20±0.5g、22±0.5g和23.5±0.5g，模型組和治療組體重均低于對照組(P值均小于0.05)，而模型組與治療組相比，對應時間點體重明顯降低(t值分別為-5.5、-6.5和-7；P值分別為0.01、0.007和0.006)，這

15、說明NAC抑制了BLM造成的小鼠體重降低。 結(jié)論 1、氧化/抗氧化失衡參與了博萊霉素誘導的急性肺損傷和肺纖維化過程，并在病理過程中具有重要作用。 2、氧化/抗氧化失衡可能通過激活NF-кB，從而調(diào)節(jié)IL-4、TGF-β1等細胞因子釋放，進而導致肺間質(zhì)纖維化的形成。 3、NAC在一定程度上可減輕博萊霉素所致的急性肺損傷和肺纖維化程度，其機制可能與NAC抑制NF—кB的活化，減少纖維化相關的細胞因子產(chǎn)生有關。