pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠CD4+NKG2D+T細胞的生物學特性研究.pdf

1、樹突狀細胞(DC)作為機體重要的一種專職抗原遞呈細胞(APC)，能有效活化初始T細胞。NK細胞可通過其表面NKG2D受體結(jié)合表達于DC表面的NKG2D配體。NK-DC之間的對話不僅影響天然免疫的功能，對獲得性免疫的形成、發(fā)展及結(jié)果有深遠的影響。為研究DC持續(xù)表達NKG2D配體對NK細胞免疫功能的影響，課題組前期制備了pCD86∶RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠，并完成轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選鑒定與免疫功能的初步分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NK細胞表面NKG2

2、D下調(diào)、免疫功能低下的同時，CD4+T細胞表面NKG2D表達上調(diào)。本研究擬進一步探討轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NK細胞表面NKG2D下調(diào)的機制，并對轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)異常增多的CD4+NKG2D+T細胞亞群的功能及其表型特征進行深入研究。
　　研究內(nèi)容分為2部分:
　　1.pCD86∶RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NKG2D介導的NK細胞功能分析
　　目的:觀察pCD86∶RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NKG2D介導的免疫功能變化，探討體內(nèi)N

3、K細胞NKG2D表達下調(diào)的機制。
　　方法:首先利用免疫熒光技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因小鼠的肝、腎、胸腺、肺、腸等組織中I-A/I-E細胞表達RAE-1ε的情況，基于流式細胞術(shù)分析轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟內(nèi)各免疫細胞表面RAE-1ε的表達。其次分析轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟NK細胞的頻率及其NKG2D表達的情況，利用CD107a標記法檢測NK細胞對Ba/F3、Ba/F3-RAE細胞的殺傷活性;并體內(nèi)觀察轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)B16BL6-MICA、B16BL6細胞生長的情

4、況，右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導腸炎發(fā)病的情況。另外，體外將轉(zhuǎn)基因小鼠DC細胞、血清分別與正常小鼠NK細胞共培養(yǎng)，觀察NK細胞表面NKG2D表達的變化。最后檢測轉(zhuǎn)基因小鼠CD4+T、CD4+NKG2D+T細胞的頻率，觀察CD4+NKG2D+T細胞膜表面是否表達TGF-β，并將CD4+NKG2D+T細胞與正常小鼠NK細胞共培養(yǎng)，檢測NK細胞NKG2D的表達。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺、腸道組織、肝臟內(nèi)檢測到I-A/I-E與RAE-

5、1ε共表達的細胞，脾臟CD11c+、CD11b+、CD19+、Gr-1+細胞上調(diào)RAE-1ε的表達，而NK1.1+、CD3+細胞無RAE-1ε的表達。與對照小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟NK細胞的頻率無明顯變化，但NKG2D表達下調(diào)至中等程度水平，NK細胞殺傷Ba/F3-RAE細胞的活性下降，而殺傷Ba/F3細胞的能力無明顯變化。轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)B16-MICA細胞的生長速度快于對照小鼠，而B16細胞的生長速度在2種小鼠間無明顯區(qū)別。DSS處理

6、的轉(zhuǎn)基因小鼠延緩了腸炎的發(fā)病。轉(zhuǎn)基因小鼠來源的DC細胞體外刺激NK細胞5天后，上調(diào)NK細胞功能，而對NKG2D的表達無明顯影響。轉(zhuǎn)基因小鼠來源的血清對NK細胞表達NKG2D無影響。轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟CD4+T細胞頻率無明顯變化，而CD4+NKG2D+T細胞的頻率明顯上調(diào)。CD4+NKG2D+T細胞膜表面表達TGF-β，與NK細胞共培養(yǎng)后下調(diào)NKG2D的表達。
　　結(jié)論:pCD86∶RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)出現(xiàn)異常增多的CD4+NKG

7、2D+T細胞，其分泌TGF-β介導NK細胞下調(diào)表達NKG2D，并下調(diào)NKG2D介導的免疫功能。
　　2.pCD86∶RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細胞的生物學特性研究
　　目的:深入分析CD4+NKG2D+T細胞的效應功能及表型特點，探討CD4+NKG2D+T細胞體外和體內(nèi)的誘生機制，并初步鑒別CD4+NKG2D+T細胞與經(jīng)典調(diào)節(jié)型T細胞(Treg)、Th17細胞的生物學特點。
　　方法:首先觀察正常

8、小鼠CD4+T細胞過繼輸入至小鼠體內(nèi)，其細胞表面NKG2D表達的變化。其次，通過胞內(nèi)細胞因子法流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因小鼠、CT-26細胞荷瘤小鼠、對照小鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細胞分泌IL-10、TGF-β、FasL、IFN-γ的情況;并將CD4+NKG2D+T細胞與CD4+NKG2DT細胞、CD8+T細胞共培養(yǎng)，觀察其抑制效應性T細胞增殖的情況;觀察CD4+NKG2D+T細胞胞漿內(nèi)顆粒酶B、穿孔素的表達，及其殺傷靶細胞活性。另外，檢

9、測CD4+NKG2D+T細胞表面CD44、CD62L的表達分析該細胞的活化狀態(tài)，檢測其表面CD69、CD127、CD25、I-A/I-E、NKG2DL、CD28、CD152的表達?；隗w外細胞實驗，觀察不同刺激劑誘導CD4+T細胞表面NKG2D的表達，并觀察不同刺激劑對CD4+NKG2D+T細胞分裂的影響;基于小鼠體內(nèi)B16-MICA、B16細胞荷瘤實驗，體內(nèi)觀察腫瘤細胞表面MICA的表達對CD4+NKG2D+T細胞的影響。最后檢測CD

10、4+NKG2D+T細胞表達Foxp3、CD223、CD39，分泌IL-17A和RORγt的轉(zhuǎn)錄情況，以與Treg和Th17細胞相鑒別。
　　結(jié)果:正常小鼠CD4+T細胞輸入轉(zhuǎn)基因小鼠后，明顯上調(diào)了NKG2D的表達。轉(zhuǎn)基因小鼠、CT-26荷瘤小鼠體內(nèi)的CD4+NKG2D+T細胞表達FasL、高分泌TGF-β、IL-10，體外可抑制CD4+NKG2D-T細胞和CD8+T細胞增殖，胞漿內(nèi)無顆粒酶、穿孔素分泌，無細胞毒活性，低分泌IFN-

11、γ。CD4+NKG2D+T細胞以效應記憶型細胞為主，高表達CD69、CD25、I-A/I-E、NKG2DL等活化分子。NKG2D在CD4+T細胞的誘導表達主要與TCR-CD3信號及NKG2DL的持續(xù)刺激有關(guān)，MICA陽性腫瘤細胞荷瘤小鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細胞的頻率明顯高于MICA陰性腫瘤細胞荷瘤小鼠。CD4+NKG2D+T細胞胞漿內(nèi)無Foxp3轉(zhuǎn)錄，細胞表面無CD223表達，高水平表達CD39分子。另外，CD4+NKG2D+T細