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文檔簡介
1、1.研究背景 目前非霍奇金淋巴瘤發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。在美國,T細胞淋巴瘤發(fā)病率約占所有非霍奇金淋巴瘤發(fā)病率的15.20%。而在中國,T細胞淋巴瘤發(fā)病率偏高,約占25-35%。與B細胞淋巴瘤相比,多數(shù)T細胞淋巴瘤預后較差,目前尚無標準治療,若按常規(guī)CHOP方案治療效果欠佳,且容易復發(fā),因此如何提高T細胞淋巴瘤治療的有效率和總生存成為當前淋巴瘤治療中的一個研究熱點。 隨著人們對信號轉導系統(tǒng)及與之相關的分子靶點藥物研究的不斷
2、深入,靶向治療己成為一種極有發(fā)展前景的腫瘤治療模式。mTOR對細胞正常生長增殖中起著極為重要的作用。許多腫瘤存在有編碼mTOR信號通路相關蛋白的基因突變,這些蛋白的表達異??梢餸TOR通路過度激活。與正常細胞相比,腫瘤細胞由于存在P13K/AKT/mTOR途徑失調(diào),對mTOR抑制劑更為敏感。以mTOR為靶點可抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡和逆轉腫瘤細胞對細胞毒性藥物的抗藥性。 RAD001是新型口服的mTOR抑制劑,具有更
3、好的水溶性以及在有機溶劑和水溶液中有更好的穩(wěn)定性。多項臨床前研究表明,RAD001單藥對多種腫瘤細胞具有抗腫瘤活性;Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗結果提示RAD001單藥不良反應輕,易為患者所接受。多項體內(nèi)外實驗結果均提示了RAD001有良好的臨床應用前景。 關于靶向治療如何與化療藥物聯(lián)合或靶向藥物彼此之間的聯(lián)合也是靶向治療的一個備受關注的問題。一些臨床前研究和臨床試驗已初步顯示由于各種藥物不同的作用機制以及藥物間的相互作用,通過改變藥物的聯(lián)
4、合用藥方式可能改變藥物間原來的拮抗作用,轉化為協(xié)同或相加作用。遺憾的是,到目前為止,RAD001治療T細胞淋巴瘤的研究資料仍非常缺乏。因此,研究RAD001對T細胞淋巴瘤抗腫瘤作用以及與其它藥物不同聯(lián)合方式的抗增殖作用,有可能為T細胞淋巴瘤的治療提供新選擇。 2.研究方法 將RAD001單藥以及其分別與化療藥物ADM、VP-16、VCR和靶向藥物Velcade、Gleevec聯(lián)合作用于人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat
5、細胞,用MTT法檢測RAD001單藥及聯(lián)合用藥對Hut-78、Jurkat細胞抗增殖作用;然后用流式細胞學(PI染色)檢測RAD001單藥對Hut-78、Jurkat細胞凋亡/周期阻滯的影響;最后提取實驗組(用RAD001單藥處理)和對照組(空白對照組和溶劑DMSO組)細胞總蛋白,通過Western Blotting分析目的蛋白p70s6k、p-p70s6k、cyclinD1、cyclinD3、cdk4在不同組間表達是否有差異。
6、 3.實驗結果 3.1 RAD001單藥對人T淋巴瘤細胞株抗腫瘤作用RAD001單藥作用于人T細胞淋巴瘤Hut-78、Jurkat細胞48小時后,測得IC50值分別為(5.57±0.08)μmol/L、(4.52±0.05)μmol/L,提示RAD001單藥對Hut-78、Jurkat細胞均有抗增殖活性,呈濃度依賴性。 3.2 RAD001與化療藥物聯(lián)合對人T淋巴瘤細胞抗腫瘤作用RAD001單藥分別與化療藥物ADM、VP
7、-16、VCR.以不同濃度梯度按一定比例混合共同作用于Hut-78、Jurkat細胞,結果顯示:在一定濃度范圍內(nèi),RAD001分別與ADM、VP-16聯(lián)合作用指數(shù)CI值均<1,提示有RAD001與ADM、VP-16均有協(xié)同作用;而RAD001和VCR聯(lián)合作用指數(shù)CI值>1,提示RAD001與VCR聯(lián)合時有拮抗作用,而且在Jurkat細胞中表現(xiàn)更為明顯。 3.3 RAD001與靶向藥物聯(lián)合作用對人T淋巴瘤細胞抗腫瘤作用RAD001
8、單藥分別與靶向藥物Velcade、Gleevec以不同濃度梯度按一定比例混合共同作用于Hut-78、Jurkat細胞,結果顯示:在一定濃度范圍內(nèi),RAD001和Velcade聯(lián)合作用CI值均<1,提示有RAD001與Velcade有協(xié)同作用,隨兩藥濃度的增加,協(xié)同作用愈為顯著;而RAD001和Gleevec聯(lián)合作用指數(shù)CI>1,提示RAD001與Gleevec聯(lián)合時有拮抗作用。 3.4研究RAD001對人T淋巴瘤細胞凋亡/周期阻
9、滯的影響RAD001作用于Hut-78、Jurkat細胞24小時后并未見明顯凋亡,延長RAD001作用時間至48小時,實驗組細胞仍未見明顯凋亡,實驗組和空白對照組、DMSO組的細胞凋亡率均無明顯差異(P<0.05)。而當RAD001作用于實驗組細胞24小時后,與對照組(空白對照組和DMSO對照組)相比,G1期細胞比例明顯增多;延長RAD001作用時間至48小時后,G1期細胞的比例較24小時實驗組也有明顯提高,這種G1期阻滯現(xiàn)象在Jurk
10、at細胞中表現(xiàn)得更為明顯。提示了RAD001對人T細胞淋巴瘤的抗增殖作用可能不是在于誘導細胞凋亡,而是通過把腫瘤細胞阻滯于G1期,從而抑制細胞生長,而其周期阻滯作用呈時間依賴性。 3.5進一步探討RAD001對人T淋巴瘤細胞抗增殖作用的分子機制 ①RAD001作用48小時后與對照組蛋白表達情況比較,發(fā)現(xiàn)Hut-78、Jurkat細胞實驗組cyclinD1、cyclinD3、cdk4表達均明顯減少或沒有表達,提示RAD00
11、1對人T細胞淋巴瘤細胞G1期相關周期蛋白有明顯抑制作用,從而是把腫瘤細胞阻滯在G1期。 ②當RAD001作用于Hut-78、Jurkat細胞48小時后,與對照組蛋白表達情況相比,發(fā)現(xiàn)p70s6k、p-p70s6k在實驗組表達明顯受到抑制,提示當RAD001作用于人T淋巴瘤細胞時,通過阻斷靶點mTOR,使P13K/AKT/mTOR信號通路的下游受到抑制,影響腫瘤細胞的周期調(diào)節(jié)和代謝等,導致腫瘤細胞生長受到抑制,從而發(fā)揮其抗增殖作用
12、。 3.6 RAD001聯(lián)合ADM或Velcade不同用藥順序?qū)ut-78細胞抗增殖作用的影響 ①通過變換RAD001和ADM、RAD001和Velcade的用藥順序,結果提示先用RAD001后再用ADM或Velcade,兩者存在拮抗作用,原因可能在于ADM及Velcade都是G2/M期阻滯的藥物,會把腫瘤細胞阻滯在G2/M期,若先用RAD001會使Hut-78細胞阻滯在G1期,而再用ADM或Velcade就不能使腫瘤
13、細胞進入G2/M期。 ②為了進一步探討先用RAD001后用ADM或Velcade之間的拮抗作用,我們把RAD001先作用于Hut-78細胞,24h后更換培養(yǎng)基去除其中的RAD001,然后再加入ADM或Velcade作用24h,結果表明去除培養(yǎng)基中的RAD001后ADM或Velcade就可以使G1期的細胞進入G2期。 4.結論 1)RAD001單藥對人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat細胞均有良好抗增殖作用;
14、 2)RAD001與化療藥物ADM、VP-16聯(lián)合作用于人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat細胞均提示有協(xié)同作用,而RAD001與VCR聯(lián)合作用于Hut-78細胞和Jurkat細胞具有拮抗作用; 3)RAD001與靶向藥物Velcade聯(lián)合作用于人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat細胞均提示有協(xié)同作用,而RAD001與Gleevec聯(lián)合作用于Hut-78、Jurkat細胞具有拮抗作用; 4)RAD001對人T淋巴瘤Hu
15、t-78、Jurkat細胞的抗增殖作用可能是通過把腫瘤細胞阻滯于G1期,而未發(fā)現(xiàn)RAD001對Hut-78、Jurkat細胞有誘導作用; 5)RAD001對人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat細胞抗增殖作用的分子機制可能是通過阻斷mTOR靶蛋白下調(diào)了P13K/Akt/mTOR下游通路和抑制了G1期周期相關蛋白cycliD1、cyclinD3和cdk4等,從而抑制了腫瘤細胞生長。 6)RAD001和ADM或Velcade聯(lián)
16、用時,不同用藥順序?qū)ut-78細胞抗增殖活性不同。 ①先用RAD001后用ADM,在周期阻滯方面兩者會產(chǎn)生拮抗作用,而當去除了培養(yǎng)基中的RAD001后,RAD001對ADM周期阻滯的拮抗作用消除。 ②先用RAD001后用Velcade,在周期阻滯方面兩者會產(chǎn)生拮抗作用,而當去除了培養(yǎng)基中的RAD001后,RAD001對Velcade周期阻滯的拮抗作用消除。 ③目前RAD001在臨床試驗中的推薦用法是連續(xù)每天口服
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