特發(fā)性炎癥性肌病肌組織中腺苷及腺苷受體的分析.pdf

1、研究背景和目的：
　　 特發(fā)性炎癥性肌病(IIMs)是一組非感染性炎癥性肌病，以骨骼肌中炎癥細(xì)胞浸潤及肌纖維萎縮、壞死為主要病理特征，其原因和發(fā)生機(jī)制不清。以多發(fā)性肌炎(PM)、皮肌炎(DM)和包涵體肌炎(IBM)3個亞型最為多見。
　　 腺苷是細(xì)胞自分泌或旁分泌途徑中的信號分子，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起重要作用。腺苷可以抑制氧化爆發(fā)和腫瘤壞死因子α等炎癥因子，在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)方面起重要作用，在敗血癥患者和克隆恩病動物

2、模型中均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外腺苷水平升高。腺苷主要通過與其受體結(jié)合起作用，腺苷受體檢測是判斷腺苷發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 腺苷受體(AR)分四型：A1AR、A2AAR、A2BAR、A3AR，均為G蛋白偶聯(lián)的七跨膜受體。Lynge J等采用免疫組織化學(xué)法和western-blotting法檢測人類骨骼肌腺苷受體A1AR、A2AAR和A2BAR的分布，結(jié)果觀察到骨骼肌僅表達(dá)A2AAR和A2BAR，肌纖維膜和胞漿中均有表達(dá)，而A

3、1AR不表達(dá)。1993年Sajijadi FG等采用RT-PCR技術(shù)對A3AR進(jìn)行克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)A3AR在人的骨骼肌組織幾乎不表達(dá)。
　　 細(xì)胞外腺苷的來源：一方面，腺苷單磷酸(AMP)在細(xì)胞外的5’-核苷酸酶(CD73)作用下脫磷酸產(chǎn)生腺苷。AMP來自于細(xì)胞外的腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)在三磷酸核苷脫磷酸酶(NTPDase)等作用下脫磷酸生成。細(xì)胞外的NTPDases有多種，CD39是細(xì)胞外主要的腺苷酸脫

4、磷酸酶，CD39L1也是一種常見的細(xì)胞外的NTPDase。另一方面，炎性細(xì)胞釋放腺苷，也是細(xì)胞外腺苷的重要來源。
　　 因此，我們檢測A2AAR、A2BAR和A3AR在人骨骼肌纖維的表達(dá)，IIMs患者肌肉組織腺苷受體表達(dá)以及細(xì)胞外腺苷生成相關(guān)酶表達(dá)的變化，探討腺苷途徑作為肌肉組織的自身保護(hù)機(jī)制在炎癥性肌病狀態(tài)下的改變，為IIMs的治療探索新的方向。
　　 研究對象與方法：
　　 選取臨床有肌無力癥狀但肌活檢病理無

5、神經(jīng)肌肉損害表現(xiàn)者17例，四肢來源的骨骼肌14例，豎脊肌3例檢測AR表達(dá)。收集30例IIMs患者骨骼肌活檢組織標(biāo)本，其中DM患者15例、PM患者11例、IBM患者4例，肌活檢大致正常者14例(活檢部位均為四肢骨骼肌)作為正常對照，F(xiàn)SFID患者5例作為炎癥特異性對照。
　　 對肌活檢組織行western印跡分析、免疫組織化學(xué)染色，比較IIMs患者A2AAR、A2BAR、A3AR以及細(xì)胞外腺苷生成相關(guān)酶CD73、CD39、CD30

6、L1與正常對照的差別。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用studentt檢驗(yàn)；分類資料進(jìn)行x2檢驗(yàn)，頻數(shù)<1時，采用Fisher。確切概率法進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水平P<0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.微量肌肉組織Western印跡分析可見A2AAR、A2BAR、A3AR條帶。
　　 2.骨骼肌A2AAR、A2BAR和A3AR抗體免疫熒光染色陽性：
　　

7、 A2AAR抗體免疫熒光染色陽性僅見于肌纖維膜，胞漿無明顯著色，間質(zhì)和血管無明顯著色；A2BAR抗體免疫熒光染色陽性主要見于1型肌纖維胞漿；A3AR抗體免疫熒光染色陽性主要見于2型肌纖維胞漿和血管平滑肌，2型肌纖維胞漿熒光強(qiáng)度+，血管平滑肌熒光強(qiáng)度+++，肌纖維膜無明顯著色。
　　 3.Western印跡分析顯示3例豎脊肌A2AAR、A2BAR、A3AR條帶均較四肢骨骼肌的相應(yīng)條帶寬。
　　 4.IIMs患者非壞死纖維A

8、2AAR、A2BAR和AAR抗體免疫熒光染色較正常對照增強(qiáng)；western blot分析A2AAR、A2BAR條帶灰度值較正常對照增加，A3AR條帶灰度值較正常對照無顯著差別。部分壞死肌纖維A3AR抗體免疫熒光染色呈強(qiáng)熒光反應(yīng)。
　　 5.細(xì)胞外腺苷生成相關(guān)酶CD73抗體染色見于炎癥部位的肌筋膜、肌內(nèi)膜和部分形態(tài)正常肌纖維內(nèi)膜，非炎癥部位的肌間質(zhì)中也有深染；CD39和CD39L1抗體染色在肌纖維無著色，CD39陽性見于血管內(nèi)皮細(xì)

9、胞，CD30L1陽性見于肌內(nèi)末梢神經(jīng)周圍和肌梭內(nèi)。
　　 結(jié)論：
　　 1.微量肌肉組織Western印跡分析證實(shí)人骨骼肌表達(dá)A2A、A2B和A3型腺苷受體。
　　 2.A2AAR表達(dá)于肌纖維膜，A2BAR主要表達(dá)于1型肌纖維胞漿，A3AR表達(dá)于2型肌纖維胞漿和血管平滑肌。
　　 3.豎脊肌A2A、A2B和A3型腺苷受體表達(dá)量較四肢骨骼肌更高。
　　 4.Western印跡顯示IIMs患者A2AA

10、R、A2BAR表達(dá)增加，A3AR表達(dá)不增加；而抗體免疫熒光染色顯示IIMs患者非壞死肌纖維A2AAR、A2BAR和A3AR表達(dá)均增加，可能與炎癥損傷和糖皮質(zhì)激素應(yīng)用導(dǎo)致2型肌纖維數(shù)量減少有關(guān)。
　　 5.AAR在非壞死肌纖維表達(dá)增加且部分壞死肌纖維大量表達(dá)提示AAR可能對細(xì)胞的修復(fù)和死亡起雙向調(diào)節(jié)作用。
　　 6.CD73主要表達(dá)于炎癥部位的肌筋膜、肌內(nèi)膜和血管壁，小血管壁表達(dá)增強(qiáng)；非炎癥部位的肌筋膜和肌內(nèi)膜也有表達(dá)，正