白介素15在特發(fā)性肌炎發(fā)病機制中的研究.pdf

1、特發(fā)性炎性肌病是一組異質(zhì)性慢性炎性疾病，臨床特點是近端骨骼肌無力和肌肉疲勞，組織學(xué)特點是肌肉組織中單核炎性細胞浸潤。一般來說，它們可分為三個不同的亞組:多發(fā)性肌炎，皮肌炎和包涵體肌炎。雖然包括炎性細胞，細胞因子，主要組織相容性復(fù)合體(I)等在其發(fā)病中的作用已經(jīng)被認同，但到目前為止這些疾病的發(fā)病機制和病因還不完全清楚。目前對這些疾病的治療其目的也旨在改善肌肉功能，提高患者的生活質(zhì)量。大劑量的糖皮質(zhì)激素仍是最重要和最有效的治療藥物。然而，并

2、非每一位病人對此治療都有良好的反應(yīng)，而且長期的大劑量激素治療會帶來許多副作用。因此，目前大多數(shù)肌炎病人的治療都會同時聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制治療藥物。這種聯(lián)合治療在一定程度上可進一步提高患者的預(yù)后，也可降低大劑量糖皮質(zhì)激素治療所帶來的風(fēng)險。但是，仍然有相當(dāng)一部分患者對這種聯(lián)合治療無效。因此，病人迫切需要新的、更有針對性的、個體化的治療藥物和治療方案。
　　 在過去十年，尤其是由于白細胞介素-1α，白細胞介素-1β，腫瘤壞死因子α，高遷移

3、率族蛋白1在其病人肌肉組織中過度表達的發(fā)現(xiàn)，細胞因子在特發(fā)性炎性肌病患者發(fā)病機制中的重要作用開始逐漸被人們認識。而且，人們進一步發(fā)現(xiàn)這些細胞因子的水平與特發(fā)性炎性肌病患者的肌肉功能障礙相關(guān)。然而，在過去幾年當(dāng)中，使用拮抗這些細胞因子的生物治療，如阿達木單抗（抗腫瘤壞死因子-α）或阿那白滯素（白細胞介素-1α受體拮抗劑），其分別能阻斷腫瘤壞死因子-α或白細胞介素-1的信號通路，其效果卻并不理想。其療效在不同病人當(dāng)中常常差異顯著，有時是相互

4、矛盾的。但是筆者認為這些“經(jīng)典”細胞因子的阻斷治療的失敗，恰恰可能提示我們在特發(fā)性肌炎中很可能存在一些其他的細胞因子參與其疾病的發(fā)病機制。
　　 白細胞介素-15屬于4α-螺旋束細胞因子家族，在結(jié)構(gòu)上與白細胞介素-2存在一定的同源性。最初它的發(fā)現(xiàn)是由于其有類似與白細胞介素-2的功能--T細胞活化因子。但后來人們發(fā)現(xiàn)它在其他細胞的發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要角色，如自然殺傷細胞，自然殺傷-T細胞，腸上皮內(nèi)淋巴細胞等。白細胞介素-15通過

5、結(jié)合其受體發(fā)揮其職能。其受體包括三個不同的組成部分，白細胞介素-2Rα，共同伽瑪鏈(γC)和其專屬的白細胞介素15受體.
　　 在轉(zhuǎn)錄水平白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α存在于各種正常的人體組織和細胞中，包括骨骼肌細胞。但由于在翻譯水平的嚴格調(diào)控，白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α很少在蛋白質(zhì)水平被檢測到。但是最近有研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性疾病的患者當(dāng)中，可在其病變組織中檢測到白細胞介素-15蛋白的存在。如在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)

6、炎患者的關(guān)節(jié)液和滑膜中可發(fā)現(xiàn)白細胞介素15的表達。在特發(fā)性炎性肌病中，基于三個多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者的一份報告表明，白細胞介素-15主要表達在肌炎患者的肌纖維中，同時其報道也顯示這些患者的成肌細胞也表達白細胞介素-15。也有報道發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清中白細胞介素-15的水平升高。以上觀察顯示白細胞介素-15很可能在特發(fā)性炎性肌病的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用。
　　 本論文的研究目的旨在探討在多發(fā)性肌炎或皮肌炎患者中，經(jīng)

7、常規(guī)免疫抑制治療后，其肌肉組織白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α的蛋白表達變化。同時也進一步探討在更分化的肌管細胞中的白細胞介素15的表達。
　　 為了進行此研究，我們采用免疫組化的方法檢測了17名多發(fā)性肌炎或皮肌炎患者在常規(guī)免疫抑制治療前后其肌肉活檢標(biāo)本中白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α的蛋白表達變化。作為對照，我們同時采集并檢測了4名肌營養(yǎng)不良癥患者和7名健康同齡人的肌肉活檢樣本。同時利用不同的標(biāo)記抗體我們也檢

8、測了這些患者肌肉組織炎性細胞浸潤的特點，CD68陽性（總巨噬細胞的標(biāo)記），CD163的（活化巨噬細胞的標(biāo)志），CD3(T細胞的標(biāo)志)，NKp46（自然殺傷細胞標(biāo)記）。然后我們采用計算機圖像分析進行染色量化。白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α量化我們采用陽性染色細胞數(shù)對總體細胞數(shù)的百分比。而巨噬細胞，T細胞，自然殺傷細胞的量化我們采用陽性染色組織面積對總組織面積的百分比。我們采用免疫熒光染色對白細胞介素-15進行細胞定位。病人的臨床

9、功能我們采用肌肉功能指數(shù)，人工肌肉測試和血清肌酸磷酸激酶來評估。最后，我們從新鮮的人體肌肉組織標(biāo)本中分離肌原細胞，并將其培養(yǎng)成成肌細胞，然后將這些成肌細胞進一步分化為肌管細胞后采用免疫細胞化學(xué)的方法對其進行白細胞介素-15的蛋白檢測。
　　 我們的研究結(jié)果顯示，白細胞介素-15主要存在于多發(fā)性肌炎或皮肌炎患者肌肉組織的單核炎性細胞中，在其毛細血管和大血管的內(nèi)皮細胞中也有少量的白細胞介素-15表達。白細胞介素-15受體α則在單核炎

10、性細胞，毛細血管和大血管的內(nèi)皮細胞中均有大量表達。巨噬細胞和T細胞大量存在于患者的肌肉組織中，但很少檢測到自然殺傷細胞。雙重免疫熒光染色顯示CD163陽性巨噬細胞表達自細胞介素-15。免疫熒光染色還顯示白細胞介素-15陽性細胞與CD3陽性T細胞在空間位置上彼此靠近。而且白細胞介素-15陽性細胞數(shù)與T細胞數(shù)存在正相關(guān)關(guān)系。在肌營養(yǎng)不良癥患者的肌肉組織標(biāo)本中也同樣可以檢測到白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α的表達，其表達模式與特發(fā)性炎

11、性肌病患者基本類似。在同齡健康對照組的肌肉組織標(biāo)本中也可以偶爾檢測到白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α的表達。統(tǒng)計結(jié)果顯示特發(fā)性肌炎病人肌肉組織中的白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α陽性細胞數(shù)明顯高于健康對照組。免疫抑制治療前白細胞介素-15的表達與患者肌肉功能的改善呈負相關(guān)。常規(guī)免疫抑制治療后，白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α陽性細胞數(shù)量均明顯降低。巨噬細胞數(shù)在常規(guī)免疫抑制治療后也明顯減少，T細胞的水平雖然呈減少趨

12、勢，但未達到統(tǒng)計學(xué)意義。然而，相比較于健康對照組的白細胞介素-15的水平，在17名特發(fā)性肌炎患者中，8名患者的肌肉組織中在經(jīng)過免疫抑制治療后仍然存在大量的白細胞介素-15陽性細胞，而且該8位患者的肌肉功能的改善情況無論從短期觀察還是長期觀測都遠低于其他9名患者。免疫細胞化學(xué)結(jié)果表明，肌管的白細胞介素-15染色呈陰性。
　　 與之前的研究結(jié)果相比，本研究的新穎性在于:（一）我們對白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α在不同細胞中

13、的表達進行了研究;（二）我們對白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α的表達在經(jīng)過常規(guī)免疫抑制治療后的表達進行了評估;（三）我們對白細胞介素-15的表達與患者的臨床評估結(jié)果進行了關(guān)聯(lián)分析。我們發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過免疫抑制治療后，白細胞介素-15的高表達肌炎病人，無論在其短期還是長期觀察中，其肌肉功能的改善都明顯低于白細胞介素-15低表達的肌炎病人。
　　 免疫熒光顯示肌炎患者的肌肉活檢組織中巨噬細胞表達白細胞介素-15，此發(fā)現(xiàn)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)

14、炎患者的滑膜組織中的巨噬細胞表達白細胞介素-15一致。白細胞介素-15在肌炎中的表達并不具有特異性，因為它在肌營養(yǎng)不良癥患者肌肉活檢中也可以被檢測到。我們同時用免疫熒光檢測了T細胞表達白細胞介素-15的可能性，但結(jié)果顯示T細胞并不表達白細胞介素-15。與之前的報道不同，其發(fā)現(xiàn)肌炎病人的肌纖維表達白細胞介素-15，但是無論是在患者還是健康個體的肌纖維中，我們都沒有檢測到白細胞介素-15的表達。這種差異可能來源于病人本身的不同，或著也可能是

15、由于染色方法的差異。但是我們的免疫細胞化學(xué)顯示完全分化的肌管不表達白細胞介素-15，這從一定程度上驗證了我們的結(jié)果-肌纖維不表達白細胞介素-15。
　　 與白介素-15類似，白介素-15受體α也表達于肌炎患者肌肉組織的單核炎性浸潤細胞中。統(tǒng)計結(jié)果顯示白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α的表達存在很強的相關(guān)性。由于使用雙重?zé)晒馊旧?，白細胞介?15受體α產(chǎn)生非特異性染色，因而我們無法鑒定白細胞介素-15受體α表達細胞的特性。

16、我們的結(jié)果顯示白細胞介素-15除了存在于單核細胞之外，其在肌炎患者肌肉組織的毛細血管和大血管的內(nèi)皮細胞中也有大量表達，這一發(fā)現(xiàn)與其在其他組織中的內(nèi)皮細胞表達是一致的。有報道顯示白細胞介素-15可通過白細胞介素-15受體α誘導(dǎo)新生血管的生成。是否在多發(fā)性肌炎和皮肌炎的患者中白細胞介素-15也可以通過白細胞介素-15受體α介導(dǎo)血管生成，我們目前的研究尚不能回答這一問題。但筆者認為它值得進一步研究，特別是在皮肌炎的患者中，因為血管損傷在皮肌炎

17、的患者中更顯著。
　　 目前白細胞介素-15被認為通過跨介導(dǎo)而發(fā)揮其功能?？缃閷?dǎo)指白細胞介素-15受體α陽性細胞結(jié)合白細胞介素-15，然后再將白細胞介素-15提呈給表達白細胞介素-2受體β和γC亞基的細胞。T細胞表達白細胞介素-2受體β和γC亞基。骨骼肌中的T細胞浸潤的是多發(fā)性肌炎和皮肌炎的一個重要的病理特點。而且我們目前和之前的研究都顯示肌炎病人肌肉組織中浸潤的T細胞，甚至在常規(guī)免疫抑制治療后，仍然可保持在穩(wěn)定甚至是增值狀態(tài)。

18、作為最重要的T細胞活化因子，白介素-2很少在肌炎患者的肌肉組織中被發(fā)現(xiàn)，因此存在一種可能性，就是白介素-15可能替代白介素-2而在T細胞活化和增值中發(fā)揮著重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)白介素-15陽性細胞數(shù)和T細胞數(shù)存在正相關(guān)關(guān)系，而且兩者在空間位置上密切相關(guān)。這在一定程度上證實了這一可能性。
　　 我們的結(jié)果顯示免疫抑制治療前的白細胞介素-15的表達水平與肌炎病人治療后肌肉功能的改善呈負相關(guān)。而且，治療后白細胞介素-15高表達組其肌

19、肉功能的改善也明顯低于治療后低表達組。此外，五年的跟蹤調(diào)查顯示，高表達組的肌肉功能改善仍低于低表達組。因此我們認為白細胞介素-15很可能在肌炎病人的肌無力的致病因素中發(fā)揮一定的作用。然而，由于我們長期的隨訪資料只在一部分人群中進行，因此我們的研究結(jié)果需要謹慎解釋，而且需要進行更大的樣本研究證實。為減少抽樣誤差，我們常規(guī)檢測肌肉活檢組織的第一個和最后一個的活檢組織切片，以證實炎性細胞浸潤的一致性。因此，我們的研究顯示肌肉活檢可用于預(yù)后，而

20、且肌肉組織中白細胞介素-15表達可作為預(yù)后的生物標(biāo)志。
　　 我們該研究的一個局限性在于病人臨床評估方法的是不一致性。人工肌肉測試在我們收集病人臨床資料時尚未使用，因為當(dāng)時國際肌炎評估和臨床研究組(IMACS)尚未位出臺評估標(biāo)準(zhǔn)。之后隨之其納入臨床評估標(biāo)準(zhǔn)，人工肌肉測試逐漸開始在肌炎患者的臨床評估中被廣泛應(yīng)用.因此我們的長期隨訪也開始采用此方法。@總之，在該項研究中，我們發(fā)現(xiàn)了白細胞介素-15和白細胞介素-15受體α在肌炎患者肌