大骨雞、青殼蛋雞成纖維細(xì)胞庫的建立及生物學(xué)特性研究.pdf

1、本論文選取了大骨雞、青殼蛋雞等我國地方品種雞為研究對(duì)象，各品種取8日胚胎，采用組織塊細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法，分別成功地構(gòu)建了上述2個(gè)雞品種成纖維細(xì)胞庫，根據(jù)建庫要求對(duì)所建細(xì)胞系進(jìn)行生物學(xué)分析，大骨雞和青殼蛋雞兩個(gè)品種的凍存樣本含量為各19個(gè)個(gè)體和9個(gè)個(gè)體，凍存管數(shù)是91支和42支，每個(gè)個(gè)體的凍存管數(shù)為4支以上，每支凍存管的細(xì)胞數(shù)量為2～3x106個(gè)細(xì)胞/ml.試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)為典型的成纖維狀，為梭形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞在

2、生長時(shí)呈放射狀、火焰狀或旋渦狀走形。通過顯微鏡可觀察到，不同種類、不同品種間細(xì)胞形態(tài)存在差異。 2.生長曲線結(jié)果顯示，所培養(yǎng)細(xì)胞在體外的生長增殖過程中呈“S”型，經(jīng)歷了潛伏期、指數(shù)增生期和平頂期三個(gè)階段，符合細(xì)胞在體外生長的一般規(guī)律。 3.細(xì)胞凍存前后存活率結(jié)果表明，細(xì)胞復(fù)蘇后活率較凍存前有所下降，這表明細(xì)胞在冷凍、復(fù)蘇過程中可能受到一定的損傷。但活率均在90％以上。貼壁后的細(xì)胞與凍存前相比，細(xì)胞類型更純，完全為成纖維細(xì)

3、胞，傳代后細(xì)胞生長速度與凍存前基本一致。 4.在對(duì)所建細(xì)胞系進(jìn)行微生物檢測時(shí)，我們對(duì)細(xì)胞污染中常見的細(xì)菌、真菌、病毒及支原體污染進(jìn)行分析，結(jié)果均為陰性，表明培養(yǎng)物未受到細(xì)菌、真菌、病毒及支原體的污染。 5.染色體分析得出：大骨雞與青殼蛋雞二倍體染色體數(shù)目2n=78，未見異常，遺傳性能穩(wěn)定，不存在種間的交叉污染。通過對(duì)染色體的核型分析，可進(jìn)行物種的鑒定。 6.實(shí)驗(yàn)證明，lipofectin能有效介導(dǎo)重組質(zhì)粒pECF

4、P～N1轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率與細(xì)胞生長匯合程度、脂質(zhì)體包被質(zhì)粒的濃度比例及轉(zhuǎn)染時(shí)間相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)50～60％時(shí)，用4μl脂質(zhì)體介導(dǎo)2μg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染10h即可獲得較滿意的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染率分別為大骨雞28％，本青殼蛋雞32％。7.同工酶分析已被廣泛的應(yīng)用于物種分析，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)所建細(xì)胞系進(jìn)行了乳酸脫氫酶(LDH)與蘋果酸脫氫酶(MDH)的酶譜分析，表明不同物種各呈現(xiàn)其獨(dú)特的條帶，具有種屬特異性。通過比較研究，得出細(xì)胞系之間不存在交