細菌內(nèi)毒素對兔膽管良性狹窄組織中成纖維細胞生物學特性的影響.pdf

1、目的：通過制作良性膽管狹窄（benign biliary stricture，BBS）兔動物模型，獲得膽管良性狹窄標本并體外分離和培養(yǎng)良性狹窄膽管成纖維細胞。通過內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）刺激實驗，觀察LPS對體外培養(yǎng)的兔良性狹窄膽管組織中成纖維細胞的形態(tài)，增殖活性，Ⅰ、Ⅲ型膠原分泌和轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor，TGF-β1）、干擾素-γ（Interferon-γ，

2、IFN-γ）分泌的影響，探討LPS在早期膽管瘢痕愈合中的影響和其可能的作用機制。
　　 方法：通過鉗夾法建立新西蘭大白兔膽管良性狹窄動物模型[1]，造模后7天取出病變膽管，應用胰蛋白酶消化法聯(lián)合組織塊法分離培養(yǎng)膽管成纖維細胞[2-3]，用含10％胎牛血清的改良培養(yǎng)基（Dulbecco modified Eagle medium，DMEM）進行培養(yǎng)并傳代。倒置顯微鏡下觀察成纖維細胞形態(tài)。選用第3-5代膽管成纖維細胞隨機分為對照組和

3、內(nèi)毒素刺激組，應用四甲基偶氮唑鹽（Methylthiazolyltetrazolium，MTT）法檢測不同濃度（0.05μg/ml，0.10μg/ml，0.25μg/ml，0.5％μg/ml，1.00μg/ml，2.00μg/ml）LPS溶液對兔膽管成纖維細胞增殖和活力的影響；應用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測不同濃度內(nèi)毒素作用后成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原分泌的變化。

4、除了上述指標以外，還采用ELISA法檢測成纖維細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1、IFN-γ的含量，探討LPS對成纖維細胞可能具有的作用機制。
　　 結果：（1）鉗夾后的膽總管肉眼可見充血、水腫，術后7天再開腹取標本時可見膽管周圍組織有比較明顯的粘連。肝臟可見輕度淤膽表現(xiàn)。粘連組織疏松，容易分離，分離粘連后見膽管仍有淤血和腫脹，近端膽管擴張。（2）在倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的細胞呈長梭形、多角形或不規(guī)則形，細胞質(zhì)透明；細胞核大，橢圓形

5、，顏色淡。每個細胞通常含2-3個核。（3）LPS濃度在0.05-0.50μg/ml時，促進成纖維細胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型膠原合成（P<0.05），在濃度為0.100μg/ml時促進作用最為明顯，LPS刺激濃度為1.000μg/ml時則抑制成纖維細胞的增殖和Ⅰ、Ⅲ型膠原合成（P<0.05）（4）LPS刺激并傳代后各時間點成纖維細胞TGF-β1的分泌增加、同時IFN-γ的分泌減少。
　　 結論：（1）兔膽總管鉗夾法可以作為一種獲取良性狹窄