新基因ARG1對染砷后293T細胞增殖凋亡以及MAPK信號通路的影響.pdf

1、目的觀察ARG1基因?qū)?93T細胞的增殖、凋亡以及p-JNK、p-ERK表達量的影響，并探討ARG1的抗砷作用。
　　 方法（1）重組質(zhì)粒pcDNA-ARG1及空質(zhì)粒抽提后采用PCR的方法進行質(zhì)粒鑒定，最后進行質(zhì)粒DNA測序；（2）將ARG1表達質(zhì)粒pcDNA3.1-IE-ARG1及空載體對照質(zhì)粒pcDNA3.1-IE分別經(jīng)陽離子脂質(zhì)體（Lipofectamine2000)介導轉(zhuǎn)染入293T細胞后，采用熒光共聚焦顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)

2、染效果；（3）提取細胞總RNA后進行逆轉(zhuǎn)錄，然后使用Real-Time PCR的方法檢測轉(zhuǎn)染后293T細胞的ARG1表達量；
　　 （4）將實驗組pcDNA3.1-IE-ARG1-293T細胞、空白對照組pcDNA3.1-IE-293T細胞及陰性對照組293T細胞分別與0、1、2、4、8、16、32 μmol/L濃度的NaAsO2孵育48 h后，使用MTT法檢測ARG1基因?qū)ι槿径竞?93T細胞增殖的影響；（5）根據(jù)MTT結(jié)果將

3、實驗組、空白對照組及陰性對照組細胞分別與0、1、4、8 μmol/L濃度NaAsO2孵育48 h后，加入Annexin V FITC/PI凋亡試劑，采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況；同時提取細胞的蛋白后，采用Western Blot法檢測p-JNK、p-ERK蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果（1）PCR顯示我們所克隆的的基因長度正確，測序結(jié)果得出基因的序列也完全正確；（2）熒光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染有目的基因的239T細胞膜表達強綠色

4、熒光，轉(zhuǎn)染空載體細胞細胞內(nèi)表達綠色熒光呈彌散狀態(tài)，細胞計數(shù)顯示轉(zhuǎn)染率可達75-85％；（3）Real Time PCR結(jié)果表明293T細胞ARG1表達量很低，轉(zhuǎn)染后細胞ARG1的表達量是空白對照組及陰性對照組的10倍左右（p<0.05）；（4）NaAsO2在1-8 μmol/L時，ARG1基因過表達的239T細胞增殖抑制率明顯低于對照組（p<0.05），而在濃度>8 μmol/L時則沒有明顯差異（p>0.05）；（5）NaAsO2濃度≤

5、8 μmol/L時，ARG1基因過表達的239T細胞凋亡率明顯低于對照組（p<0.05）；（6）p-JNK表達量在轉(zhuǎn)染前后均隨著NaAsO2濃度的增加而增加，但是ARG1基因過表達的239T細胞的p-JNK的表達量在各濃度均明顯低于空白對照組及陰性對照組（p<0.05）；當NaAsO2的濃度在0-4 μmol/L時，ARG1基因過表達的239T細胞p-ERK的相對表達量隨著砷濃度的增加而增加，在8 μmol/L時表達量有所下降，但是仍然