DOX可誘導(dǎo)的PENK基因在293T細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：
　　以前期實(shí)驗(yàn)的載體PMT155(pLVX-TRE3G-MCS-PGK-3Gtransactivator-EGFP)構(gòu)建含有DOX誘導(dǎo)基因PENK表達(dá)的慢病毒載體PSB2034（pLVX-TRE3G-PENK-PGK-3Gtransactivator-EGFP，含開關(guān)調(diào)控和靶基因)，使其感染293T細(xì)胞，獲得能在DOX存在的情況下穩(wěn)定表達(dá)腦啡肽的293T細(xì)胞，后續(xù)的研究可以以此作依據(jù)，臨床疼痛管理也可以此擴(kuò)寬思路，尋求新療

2、法。
　　方法：
　　1.含有PENK基因的可調(diào)控載體的構(gòu)建
　　在GENE BANK上查找目的基因，確定編碼區(qū)和非編碼區(qū)，由吉?jiǎng)P基因設(shè)計(jì)引物用于釣取PENK基因和鑒定轉(zhuǎn)化子。PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增目的基因，之后使用瓊膠試劑盒進(jìn)行目的基因片段切割、回收。把回收的目的基因同源重組入表達(dá)載體構(gòu)建出載體PSB2034，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，取轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行PCR鑒定和基因測序。
　　2.293T細(xì)胞的包裝
　　復(fù)融并培養(yǎng)29

3、3T細(xì)胞使其細(xì)胞融合約80~90％。實(shí)驗(yàn)組和對照組加入質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)組pSB2034對照組pMT155） dR8.9包裝質(zhì)粒和VSVG包裝質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒的包裝，而后包裝293T，并用DOX誘導(dǎo),QPCR檢測出PENK過表達(dá)，WB檢出條帶反應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　對產(chǎn)物PSB2034進(jìn)行測序與目的基因比證明無誤；感染過程中，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)多于95%的細(xì)胞都帶有熒光，滴度檢測證明轉(zhuǎn)染成功，DOX誘導(dǎo)后可檢測出PENK基因過