腫瘤的分子轉(zhuǎn)移機(jī)理的假設(shè)和論證-一種非細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)理.pdf

1、目前惡性腫瘤是威脅人類健康，導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。盡管現(xiàn)代的診斷、外科手術(shù)技巧，以及患者的護(hù)理和相關(guān)的輔助治療已經(jīng)取得明顯得改進(jìn)，但是轉(zhuǎn)移仍然是惡性腫瘤的主要死因，而且通常的治療對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移療效不佳。 本文提出一個(gè)假設(shè)，假設(shè)在疾病過(guò)程中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的一些分子物質(zhì)在血液或組織液持續(xù)存在，積聚到器官局部或者淋巴結(jié)中，也可能順血液到達(dá)那些血流豐富的器官，如腦、肝臟、骨髓等(而這些位置通常是腫瘤轉(zhuǎn)移的好發(fā)部位)，改變了原位正常細(xì)胞的

2、組織微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞基因表達(dá)改變，出現(xiàn)細(xì)胞惡變，產(chǎn)生新的腫瘤病灶。 本文這一假設(shè)的提出豐富了腫瘤轉(zhuǎn)移理論，為腫瘤轉(zhuǎn)移的研究提供新的視野，為腫瘤的治療提供新的機(jī)會(huì)。我們的假說(shuō)是一種腫瘤分子的轉(zhuǎn)移假說(shuō)，我們并不否認(rèn)傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的理論。 如果這一假設(shè)得到驗(yàn)證，腫瘤轉(zhuǎn)移的含義不僅僅只是腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，也應(yīng)包括這些分子物質(zhì)引起的新的遠(yuǎn)隔病灶，即分子水平的轉(zhuǎn)移(molecularmetastasis)，以后的腫瘤根治術(shù)后的化療

3、、放療應(yīng)該不僅僅要?dú)⑺滥[瘤細(xì)胞，也要考慮如果減少和消除這些分子物質(zhì)，避免過(guò)度治療，也將為今后的分子靶向治療提供更廣闊的前景和空間，腫瘤的治療效果將獲得極大的提高。 為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本文擬制作一組B16黑色素瘤、LLC細(xì)胞雌性C57BL/6小鼠自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型，以Y染色體特異性SRY基因作為原代腫瘤細(xì)胞克隆的標(biāo)記物，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)移灶SRY基因鑒定轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的來(lái)源。 本文分為4章，分別闡述如下： 第一章：應(yīng)用PCR

4、檢測(cè)B16黑色素瘤、LLC細(xì)胞的SRY基因 1.目的： 應(yīng)用PCR檢測(cè)B16黑色素瘤、LLC細(xì)胞的SRY基因，為本研究篩選適用的、存在SRY基因的腫瘤細(xì)胞株。 2.方法： 1)細(xì)胞： B16黑色素瘤細(xì)胞和LLC細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。 B16細(xì)胞培養(yǎng)方法：10％FCS、0.25MHepes、100U/ml青霉素和100λg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置入5％CO2培養(yǎng)箱

5、，37℃培養(yǎng)。 LLC細(xì)胞培養(yǎng)方法：10％FCS、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置入5％CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)。 2)DNA提?。?B16黑色素瘤細(xì)胞和LLC細(xì)胞DNA提?。喊凑誘IAampGenomicDNAkit說(shuō)明書進(jìn)行。 3)PCR引物設(shè)計(jì)： 小鼠SRY基因PCR引物序列為： Sry-182-F5'-TCATCGGAGGGCTAAAGTG-3'

6、 Sry-182-R5'-TCAACAGGCTGCCAATAAA-3' Sry-430-F5'-CCACCACCACCAACAGC-3' Sry-430-R5'-TGAGACTGCCAACCACAGG-3' 在LLC細(xì)胞PCR檢測(cè)中僅使用引物Sry-182，因?yàn)檫@個(gè)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物更短，有利于反應(yīng)體系的優(yōu)化。 小鼠β-actin基因做為對(duì)照， 引物序列為：β-actin-F5'-GAGACCTT

7、CAACACCCCAGC-3' B-actin-R5'-GCCGTCAGGCAGCTCATA-3' 4)PCR： PCR反應(yīng)條件為：94℃5分鐘，35個(gè)循環(huán)的94℃15秒，65℃30秒，72℃30秒，最后72℃10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳(90V)，時(shí)間30分鐘。 3.結(jié)果： PCR檢測(cè)顯示B16黑色素瘤細(xì)胞和LLC細(xì)胞中存在SRY基因，適用于本研究。 第二章：B

8、16黑色素瘤、LLC細(xì)胞雌性C57BL/6小鼠自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型的建立 1.目的： 建立B16黑色素瘤細(xì)胞和LLC細(xì)胞雌性C57BL/6小鼠自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型，并獲取樣本用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 2.方法： 1).60只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為B16組和LLC組，每組30只。2只雌性C57BL/6小鼠分別做為B16組和LLC組陰性對(duì)照。 2).B16組：背部皮下注射細(xì)胞懸液100μl(含B16黑色素瘤細(xì)胞2

9、×106) LLC組：足墊注射LLC細(xì)胞懸液100μl(含LLC細(xì)胞2×106) 對(duì)照組：健康雌性C57BL/6小鼠1只做為B16組陰性對(duì)照，背部皮下注射不含細(xì)胞的RPMI-1640培養(yǎng)基100μ。健康雌性C57BL/6小鼠1只做為L(zhǎng)LC組陰性對(duì)照，足墊注射不含細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基100μ。 3).所有小鼠4周后處死。 3.結(jié)果： 1).B16組：原位成瘤100％(30/30)，12對(duì)肺發(fā)現(xiàn)肉眼可

10、見轉(zhuǎn)移灶(40.00％，12/30)，獲取標(biāo)本32個(gè)。5個(gè)肝臟發(fā)現(xiàn)肉眼可見病灶(16.67％，5/30)，獲取標(biāo)本18個(gè)。 2).LLC組：原位成瘤100％(30/30)，7對(duì)肺發(fā)現(xiàn)肉眼可見轉(zhuǎn)移灶(23.33％，7/30)，獲取21個(gè)。6個(gè)肝臟發(fā)現(xiàn)肉眼可見病灶(20.00％，6/30)，獲取轉(zhuǎn)移灶37個(gè)。 3).陰性對(duì)照組未見腫瘤。 第三章：應(yīng)用PCR檢測(cè)SRY基因探索B16黑色素瘤、LLC細(xì)胞雌性C57BL/6

11、小鼠自發(fā)性轉(zhuǎn)移來(lái)源 1.目的： 應(yīng)用PCR檢測(cè)SRY基因探索B16黑色素瘤、LLC細(xì)胞雌性C57BL/6小鼠自發(fā)性轉(zhuǎn)移來(lái)源。 2.方法： 1).組織DNA提?。喊凑誘IAampGenomicDNAkit說(shuō)明書進(jìn)行。 2).PCR引物設(shè)計(jì)： Sry-182-F5'-TCATCGGAGGGCTAAAGTG-3' Sry-182-R5'-TCAACAGGCTGCC從TAAA-3'

12、 3).分別以上一實(shí)驗(yàn)中兩只陰性對(duì)照組肝組織提取DNA做為陰性對(duì)照。取雄性小鼠肝組織提取DNA做為陽(yáng)性對(duì)照。 4).PCR： PCR反應(yīng)條件為：94℃5分鐘，35個(gè)循環(huán)的94℃15秒，65℃30秒s，72℃30秒，最后72℃10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳(90V)，時(shí)間30分鐘。 3.結(jié)果： PCR檢測(cè)顯示B16黑色素瘤細(xì)胞及LLC細(xì)胞雌性C57BL/6小鼠皮下原發(fā)腫瘤及肺、肝肉眼

13、可見轉(zhuǎn)移灶均有SRY基因。PCR檢測(cè)顯示陽(yáng)性對(duì)照有SRY基因，陰性對(duì)照未見SRY基因。結(jié)果顯示肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞均為皮下原發(fā)灶來(lái)源。 第四章：應(yīng)用ISH檢測(cè)SRY基因探索B16黑色素瘤、LLC細(xì)胞雌性C57BL/6小鼠自發(fā)性轉(zhuǎn)移來(lái)源 1.目的： 應(yīng)用ISH檢測(cè)SRY基因探索B16黑色素瘤、LLC細(xì)胞雌性C57BL/6小鼠自發(fā)性轉(zhuǎn)移來(lái)源。 2.方法： 1).B16組和LLC組未見肉眼可見轉(zhuǎn)移灶

14、的肺、肝組織，連續(xù)切片，相鄰切片做HE和ISH。 2).取雄性小鼠肺、肝組織為陽(yáng)性對(duì)照。 取雌性小鼠肺、肝組織為陰性對(duì)照。 3).ISH-按照MouseSRYBIOISHkit說(shuō)明書進(jìn)行。 3.結(jié)果： 雄性小鼠肺、肝組織切片細(xì)胞核顯示棕色顆粒，顯示SRY陽(yáng)性標(biāo)記。 雌性小鼠肺、肝組織切片未顯示SRY陽(yáng)性標(biāo)記。 B16組和LLC組切片ISH，微轉(zhuǎn)移灶可見細(xì)胞核顯示棕色顆粒，顯示SRY

15、陽(yáng)性標(biāo)記。顯示微轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞均為皮下原發(fā)灶來(lái)源。 結(jié)論： 本研究應(yīng)用Y染色體特異性SRY基因，首先檢測(cè)了B16黑色素瘤和LLC細(xì)胞中存在SRY基因，并構(gòu)建B16黑色素瘤和LLC細(xì)胞雌性C57BL/6小鼠自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型，其次通過(guò)PCR和ISH兩種方法對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞和LLC細(xì)胞雌性C57BL/6小鼠的自發(fā)性轉(zhuǎn)移進(jìn)行了檢測(cè)，確認(rèn)了轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞的克隆來(lái)源于原發(fā)灶。我們的研究主要取得如下結(jié)果： 1.提出了一種腫瘤的分