抗莪術(shù)醇單鏈抗體基因的構(gòu)建及其在大腸桿菌中表達研究.pdf

1、目的:利用抗體基因工程的方法得到高親和力的抗莪術(shù)醇單鏈抗體蛋白。
　　方法:利用RT-PCR及分子克隆的技術(shù)，從分泌抗莪術(shù)醇單克隆抗體的雜交瘤細胞中克隆編碼抗體重鏈及輕鏈的基因;利用重疊延伸PCR的方法構(gòu)建抗莪術(shù)醇單鏈抗體基因，并將該基因克隆到大腸桿菌表達載體中;在細菌中誘導(dǎo)表達抗莪術(shù)醇單鏈抗體，并利用ELISA的方法測定抗莪術(shù)醇單鏈抗體與莪術(shù)醇的結(jié)合能力。
　　結(jié)果:利用RT-PCR的方法獲得了抗體輕鏈及重鏈Fab片段基因

2、，并克隆在了T載體中，長度為620bp左右;測序后序列分析表明我們獲得的抗體基因為全新的抗體基因，在GeneBank中沒有報道。利用重疊延伸PCR的方法將輕鏈和重鏈基因的可變區(qū)通過多聚甘氨酸接頭連接為單鏈抗體，所得單鏈抗體基因長度為750bp左右。利用PCR克隆的方法將單鏈抗體基因3'末端加入Flag標(biāo)簽序列，并克隆到細菌表達載體pET21a中得到質(zhì)粒pET21a ScFvFlag 6 XHis(pET21ScFvFH)，測序結(jié)果表明基

3、因表達框正確，沒有發(fā)生突變。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，利用IPTG誘導(dǎo)2小時后，Western blot檢測到ScFv的表達，大約有95％的ScFv蛋白存在于包涵體，5％的ScFv蛋白為有活力的可溶性蛋白，分子量為34KD。利用ELISA檢測到ScFv蛋白高特異性抗莪術(shù)醇活力。
　　結(jié)論:此項研究工作利用基因工程的系列方法，從分泌抗莪術(shù)醇的雜交瘤細胞株中成功地構(gòu)建了抗莪術(shù)醇單鏈抗體基因，并且在細菌中表達出了可溶性單鏈