人c-Src全長(zhǎng)基因的克隆及其在大腸桿菌中表達(dá)的研究.pdf

1、本文通過(guò)構(gòu)建特異性c-src的原核表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆表達(dá)得到完整的人源c-Src蛋白。首先，運(yùn)用PCR技術(shù)，分別從人肺腺癌細(xì)胞總mRNA以及獲贈(zèng)的pcDNA3.1/Hygro質(zhì)粒中，擴(kuò)增出全長(zhǎng)的人c-src基因。經(jīng)測(cè)序鑒定該序列完全正確。然后，以克隆質(zhì)粒pUCm-T為中介酶切連接，將c-src基因重組到pET-28a(+)、pET-22b(+)和pPRoEXHTc等備選的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌中篩選陽(yáng)性重組子，并用IPTG誘

2、導(dǎo)表達(dá)、SDS-PAGE電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)pPRoEXHTc/c-src為高效的表達(dá)重組質(zhì)粒，而在pET系列的重組質(zhì)粒中c-src基因得不到明顯表達(dá)。工程菌通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的表達(dá)條件是：30℃、0.1mMIPTG、5h，然后大量表達(dá)得到(His)6/c-Src融合蛋白，在全菌蛋白表達(dá)含量中可以占20％以上。最后用(His)6-Tag特異性親和的Ni2+-NTA層析柱分離純化，得到的高純度c-Src融合蛋白，與經(jīng)變性透析處理的包涵體蛋白分別測(cè)