具核梭桿菌對(duì)牙齦卟啉單胞菌和伴放線(xiàn)聚集桿菌致病作用的影響.pdf

1、目的:牙周炎是多種細(xì)菌混合感染所致的口腔炎癥性病變，可以導(dǎo)致牙周支持組織的破壞和牙齒的松動(dòng)脫落。以往的研究表明，牙周組織的細(xì)菌性感染是由口腔菌群和其周?chē)纳掀ぜ?xì)胞相互作用的結(jié)果。因此，研究不同種類(lèi)的牙周致病菌及其宿主細(xì)胞之間的互動(dòng)影響是非常必要的。
　　到目前為止，在齦下菌斑生物膜中發(fā)現(xiàn)至少有300多種不同種類(lèi)的細(xì)菌。齦下細(xì)菌的聚集有一定規(guī)律，按照它們的聚集特點(diǎn)以及與牙周狀況的關(guān)系，分為6個(gè)主要的微生物復(fù)合體。與牙周炎關(guān)系緊密的牙

2、齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis, Pg)和伴放線(xiàn)聚集桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa)分別為紅色復(fù)合體和綠色復(fù)合體。然而，他們經(jīng)常在橙色復(fù)合體存在的環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)，比如有具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)的微生態(tài)系。Fn是一種有致病潛力的口腔共生菌，其獨(dú)特之處是能夠與幾乎所有的口腔細(xì)菌發(fā)生共聚，可以作為共聚橋連接早期定植的

3、細(xì)菌和晚期定植的細(xì)菌。因其具有廣泛的共聚能力被認(rèn)為在牙菌斑成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在牙周病變的進(jìn)展過(guò)程中起到了間接的促進(jìn)作用。此外，有研究表明Fn能夠與Pg和Aa相互影響。
　　與其他感染性疾病相似，致病菌對(duì)上皮細(xì)胞表面的粘附和隨即發(fā)生的入侵過(guò)程是牙周炎發(fā)病的關(guān)鍵階段。數(shù)十年以來(lái)，致病菌的入侵能力一直被認(rèn)為是牙周炎的潛在致病因子。由于不同菌種之間的相互作用，Pg、 Aa與Fn的相互共聚、同時(shí)感染可能會(huì)影響它們對(duì)牙齦上皮細(xì)胞的粘附和

4、入侵。
　　細(xì)菌與其周?chē)掀ぜ?xì)胞間的相互作用是細(xì)菌感染過(guò)程中的重要階段，牙齦上皮細(xì)胞既是物理性屏障，同時(shí)還傳遞細(xì)菌信號(hào)，是檢測(cè)細(xì)菌存在的傳感器，維持健康和疾病之間的平衡。在先天性免疫防御機(jī)制中，細(xì)菌與上皮細(xì)胞之間的相互作用可以刺激上皮細(xì)胞表達(dá)多種免疫反應(yīng)介質(zhì)。其中，白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)是一種強(qiáng)有效的致炎因子，能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞的趨化、激活中性粒細(xì)胞并且誘導(dǎo)其增殖。而β-防御素族的人β-防御素2(h

5、umanβ-defensin2，hBD-2)不僅可以吸引單核細(xì)胞、促進(jìn)中性粒細(xì)胞的趨化，也能夠激活先天性和獲得性免疫防御。在先天性免疫應(yīng)答中，橙色復(fù)合體中的細(xì)菌和紅色復(fù)合體中的細(xì)菌所產(chǎn)生的功效是不同的，分別歸屬于兩種不同復(fù)合體的細(xì)菌間的相互影響可能會(huì)調(diào)節(jié)IL-8和hBD-2的表達(dá)，從而在牙齦組織的免疫調(diào)節(jié)方面產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。
　　因此，本研究的目的在于觀(guān)察Fn與主要的牙周致病菌Pg、Aa的相互共聚、同時(shí)感染對(duì)Pg、 Aa粘附和入侵牙

6、齦上皮細(xì)胞能力的影響，以及對(duì)牙齦上皮細(xì)胞IL-8的生成和hBD-2表達(dá)的影響。Pg、Aa單獨(dú)粘附和入侵牙齦上皮細(xì)胞，以及Pg、Aa與Fn相互共聚、同時(shí)感染時(shí)粘附和入侵牙齦上皮細(xì)胞的能力均被檢測(cè)。此外，Pg、Aa單獨(dú)或與Fn相互共聚、同時(shí)感染牙齦上皮細(xì)胞時(shí)，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR，RT-PCR)分別測(cè)定牙齦上皮細(xì)胞

7、IL-8和hBD-2的表達(dá)。
　　方法:1、Pg、Aa單獨(dú)或與Fn相互共聚、同時(shí)感染時(shí)粘附和入侵Ca9-22細(xì)胞能力的研究
　　牙齦上皮細(xì)胞接種于12孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為2.0×105/孔，每孔1ml。在致感染之前，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate-buffered saline，PBS，pH7.4)洗兩遍，用無(wú)抗生素的最小必需培養(yǎng)基（minimal essential medium，MEM）培養(yǎng)2小時(shí)。

8、三種不同的菌種接種于腦心浸液肉湯(Sigma, USA)上，補(bǔ)充0.5％的酵母提取物，氯化血紅素(5μg/ml)和維生素K1(5μg/ml)，細(xì)菌培養(yǎng)2天直到OD660nm達(dá)到1.0。經(jīng)PBS洗過(guò)之后，菌細(xì)胞懸浮于MEM。細(xì)菌懸液(2.0×107/孔)加入鋪滿(mǎn)的單層Ca9-22細(xì)胞中，在37℃、5％ CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　在粘附部分的檢測(cè)中，細(xì)菌與單層Ca9-22細(xì)胞孵育1小時(shí)，然后單層細(xì)胞用PBS洗四遍，去除未粘附的細(xì)菌。

9、接下來(lái)每孔加入1ml的無(wú)菌蒸餾水用于裂解細(xì)胞達(dá)90分鐘，將溶解產(chǎn)物稀釋1000倍，接種于腦心浸液血瓊脂平板(Brain HeartInfusion agar-Supplemented，BHI-S)，每板100μl菌液，在37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)10天。
　　在入侵部分的檢測(cè)中，細(xì)菌與單層Ca9-22細(xì)胞孵育4小時(shí)。在接下來(lái)的孵育過(guò)程中，單層細(xì)胞用PBS洗四遍，去除未粘附的細(xì)菌，接種于含200μg/ml甲硝唑和300μg/ml的慶大霉素

10、的MEM中培養(yǎng)1小時(shí)，殺滅粘附于細(xì)胞外面的細(xì)菌。暴露于抗生素之后，單層細(xì)胞經(jīng)PBS洗兩遍，用每孔1ml的無(wú)菌蒸餾水裂解細(xì)胞90分鐘。將溶解產(chǎn)物稀釋100倍，接種于BHI-S血瓊脂平板，每板100μl菌液，在37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)10天。
　　粘附和入侵的微生物所形成的菌落形成單位按照接下來(lái)的孵育狀況進(jìn)行計(jì)算，細(xì)菌粘附和入侵的能力用細(xì)胞溶菌作用后重新獲得的細(xì)菌相對(duì)于起初加入的細(xì)菌總量的百分率表示。
　　2、Pg、Aa單獨(dú)或與Fn

11、相互共聚、同時(shí)感染Ca9-22細(xì)胞時(shí)IL-8和hBD-2表達(dá)的研究
　　為了檢測(cè)Ca9-22細(xì)胞所分泌的IL-8的總量，細(xì)菌懸液(2.0×107/孔)加入鋪滿(mǎn)Ca9-22的單層細(xì)胞中37℃、5％ CO2孵育4小時(shí)。然后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，-20℃保存。ELISA定量分析細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-8的濃度，用鼠IL-8單克隆抗體(1∶100，Dako)作為捕獲抗體包被微孔板。重組IL-8或在測(cè)試樣品中捕獲的鼠抗體通過(guò)加入的兔IL-8多克

12、隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，隨即加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶200，Dako)和鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)以及HRP底物2，2'-聯(lián)氮基雙。37℃孵育45分鐘，測(cè)試樣品中IL-8的濃度通過(guò)已知濃度的重組β溶血性鏈球菌(beta-hemolytic streptococcal，BHS)和IL-8所生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)得。
　　從Ca9-22細(xì)胞提取的總RNA（2微克）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用(dT

13、)18和SuperscriptⅡ酶（Invitrogen），反應(yīng)混合物25微升，42℃反應(yīng)1小時(shí)。在20微升體系中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，反應(yīng)混合物含有1微升模板cDNA、SYBR Premix Ex Taq、ROXReference Dye（Sigma, USA）和每一種引物（0.2微摩爾）。使用的引物序列是:GAPDH正向引物，5'-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3'和反向引物5'-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3'

14、; hBD-2正向引物5'-AGACTCAGCTCCTGGTCAAGCTC-3'和反向引物5'-TGGCTCCACTCTTAAGGCAGGTA-3'。為了防止擴(kuò)增出污染的基因組DNA，所有的引物被設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增至少兩個(gè)外顯子。擴(kuò)增在熒光熱循環(huán)儀(StepOne Plus)中按照以下條件進(jìn)行:94℃預(yù)變性1分鐘，然后是95℃變性15秒、62℃退火15秒和72℃延伸33秒，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析和3％瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特

15、異性。在目的基因擴(kuò)增的同時(shí)也擴(kuò)增管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，使用2-△CT計(jì)算相比GAPDH的相對(duì)拷貝數(shù)。
　　結(jié)果:1、Pg、Aa單獨(dú)或與Fn相互共聚、同時(shí)感染時(shí)粘附和入侵Ca9-22細(xì)胞能力的研究
　　Pg、Aa和Fn單獨(dú)粘附細(xì)胞的能力分別是0.97±0.38％，2.62±0.58％和1.06±0.30％。Pg與Fn相互共

16、聚、同時(shí)感染時(shí)，Pg粘附Ca9-22的能力被明顯增強(qiáng)至兩倍（P＜0.05）。Aa粘附Ca9-22細(xì)胞的能力在Fn存在的狀態(tài)下比A2處理組約升高178.24％(P＜0.05)。這些結(jié)果顯示與Fn共同孵育后的Pg、Aa粘附Ca9-22細(xì)胞的能力被增強(qiáng)，然而這樣的效果可以被Fn的粘附、入侵抑制劑半乳糖所抑制。
　　Pg、Aa和Fn單獨(dú)入侵細(xì)胞的能力分別是0.35±0.08％，1.01±0.15％和0.44±0.11％。Pg、 Aa入侵C

17、a9-22細(xì)胞的能力在Fn存在的狀態(tài)下比缺乏Fn時(shí)分別顯著增強(qiáng)251.43％和207.92％(P＜0.05)。這些結(jié)果表明Fn能夠有效增強(qiáng)Pg、Aa入侵Ca9-22細(xì)胞的能力，然而這樣的效果可以被半乳糖所抑制。
　　2、Pg、Aa單獨(dú)或與Fn相互共聚、同時(shí)感染Ca9-22細(xì)胞時(shí)IL-8和hBD-2表達(dá)的研究
　　在單種細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)中，A3處理組中Ca9-22細(xì)胞的IL-8產(chǎn)生量最高(428.75pg/ml)，相反的，IL-

18、8產(chǎn)生量最低的為A1處理組(386.66 pg/ml)。在多種細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)中，與A3處理組相比，B1和B2處理組中IL-8的產(chǎn)生量分別降低6.12％和8.05％。而在C1-C4處理組中，IL-8的產(chǎn)生量均比B1-B4處理組輕度升高(P＜0.05)。
　　在單種細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)中，A3處理組中Ca9-22細(xì)胞hBD-2 mRNA的表達(dá)最高(0.48)，相反的，hBD-2 mRNA表達(dá)最低的為A1處理組(0.26)。在多種細(xì)菌感染的實(shí)

19、驗(yàn)中，與A3處理組相比，B1和B2處理組中hBD-2 mRNA的表達(dá)分別降低66.94％和51.39％。與此同時(shí)，在C1-C4處理組中，hBD-2 mRNA的表達(dá)均相應(yīng)的比B1-B4處理組有所升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、與Fn共聚后，Pg和Aa粘附、入侵牙齦上皮細(xì)胞的能力被增強(qiáng)，增強(qiáng)效果可以被半乳糖所抑制。
　　2、與Fn共聚后的Pg和Aa下調(diào)牙齦上皮細(xì)胞IL-8的生成和hBD-2的表達(dá)，下調(diào)程度可以被半乳糖所抑制