甲基強(qiáng)的松龍與促紅細(xì)胞生成素聯(lián)合應(yīng)用對原代星形膠質(zhì)細(xì)胞作用的研究.pdf

1、第一部分原代星形膠質(zhì)細(xì)胞模型制作及鑒定 目的:通過新生鼠大腦制作原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定和星形膠質(zhì)細(xì)胞純度測定 方法:采用出生三天內(nèi)的SD大鼠大腦制成細(xì)胞懸濁液后，按1.5×107計(jì)數(shù)接種于已用0.01％多聚賴氨酸包被好的底面積為75cm2培養(yǎng)瓶中，放置于培養(yǎng)箱中(5％CO2，95％O2，37℃)培養(yǎng)，采用含15％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)7d，通過搖床和逐漸傳代純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察細(xì)胞的變化，通過免疫熒光染色鑒

2、定星形膠質(zhì)細(xì)胞。 結(jié)果:通過搖床與高血清培養(yǎng)可獲得高純度星形膠質(zhì)細(xì)胞，并隨逐漸傳代更加純化，形態(tài)也逐漸變化，培養(yǎng)的細(xì)胞GFAP染色呈陽性，顯示正常星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體呈多角形，胞膜光滑，邊界清楚，突觸長且多相互連接，GFAP陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)比例在95％以上。 結(jié)論:通過新生鼠大腦制作原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，高血清培養(yǎng)基和搖床后培養(yǎng)可獲得高純度的星形膠質(zhì)細(xì)胞。 第二部分原代星形膠質(zhì)細(xì)胞缺營養(yǎng)損傷模型制作 目的:制作

3、理想的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷模型，觀察形態(tài)變化 方法:采用出生三天內(nèi)的SD大鼠大腦制成細(xì)胞懸濁液后，采用含15％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，通過搖床和逐漸傳代純化星形膠質(zhì)細(xì)胞。采用PBS緩沖液代替培養(yǎng)基模擬缺營養(yǎng)模型，缺營養(yǎng)3h后恢復(fù)營養(yǎng)，觀察細(xì)胞缺營養(yǎng)前后形態(tài)變化。 結(jié)果:缺營養(yǎng)3h后部分細(xì)胞胞體變小，突觸變短，細(xì)胞間相互連接減少或消失，個(gè)別細(xì)胞呈圓形，復(fù)營養(yǎng)后大多數(shù)細(xì)胞胞體變大，突出變長并相互交錯(cuò)，基本恢復(fù)缺營前

4、形態(tài)，個(gè)別細(xì)胞死亡成圓形。 結(jié)論:高血清培養(yǎng)和搖床后可獲得高純度的星形膠質(zhì)細(xì)胞，原代星形膠質(zhì)細(xì)胞可耐受一定的缺營養(yǎng)損傷，恢復(fù)營養(yǎng)后可基本恢復(fù)至損傷前的形態(tài) 第三部分甲基強(qiáng)的松龍與促紅細(xì)胞生成素聯(lián)合應(yīng)用對原代星形膠質(zhì)細(xì)胞作用的研究 目的:研究甲基強(qiáng)的松龍(MPSS)與促紅細(xì)胞生成素(EPO)單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用對體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用。 方法:采用出生3d內(nèi)的SD大鼠大腦制成細(xì)胞懸濁液，采用含15％的

5、胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，通過搖床和逐漸傳代純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，按1.5×107計(jì)數(shù)接種于已用0.01％多聚賴氨酸包被好的底面積為75cm2培養(yǎng)瓶中，放置于培養(yǎng)箱中(5％CO2,95％O2，37℃)培養(yǎng)，通過搖床和逐漸傳代純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為正常組、正常+MPSS組、正常+EPO組、正常+MPSS+EPO組、損傷組、損傷+MPSS組、損傷+EPO組、損傷+MPSS+EPO組。通過PBS緩沖液代替培養(yǎng)基模擬缺營養(yǎng)模型3小時(shí)后即刻分

6、別加入甲基強(qiáng)的松龍(10umol/l)、促紅細(xì)胞生成素(10u/l)、甲基強(qiáng)的松龍(10umol/l)與促紅細(xì)胞生成素(10u/l)，然后分別繼續(xù)培養(yǎng)三天，免疫熒光技術(shù)鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞；MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性和凋亡；PCR技術(shù)測定細(xì)胞GFAPRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果:星形膠質(zhì)細(xì)胞搖床后傳至第三代，經(jīng)鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)95％以上；缺營養(yǎng)3h后部分細(xì)胞胞體變小，突觸變短，細(xì)胞間相互連接減少或消失，個(gè)別細(xì)胞呈圓形，復(fù)營養(yǎng)后大多

7、數(shù)細(xì)胞胞體變大，突出變長并相互交錯(cuò)，基本恢復(fù)缺營前形態(tài)，個(gè)別細(xì)胞死亡成圓形；正常組和損傷組分別加入MPSS、EPO、MPSS和EPO三天后，損傷組細(xì)胞活性與GFAP表達(dá)均明顯升高，并且聯(lián)合應(yīng)用MPSS與EPO與單獨(dú)應(yīng)用MPSS、EPO相比，細(xì)胞活性與GFAP表達(dá)明顯升高，但是正常組沒有明顯變化。 結(jié)論:適當(dāng)劑量的MPSS與EPO聯(lián)合應(yīng)用對缺營養(yǎng)損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用，并且與單獨(dú)應(yīng)用MPSS、EPO相比有顯著性作用，而