促紅細(xì)胞生成素對(duì)脫離視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、目的：觀察內(nèi)源性及外源性EPO對(duì)脫離視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的保護(hù)作用并探討其可能機(jī)制。 方法：采用視網(wǎng)膜下腔注射1.4％透明質(zhì)酸鈉建立大鼠RD模型，分別于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)EPO和EPOR的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化并采用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行定位。為觀察EPOsR對(duì)正常視網(wǎng)膜神經(jīng)元存活的影響，2、20、200ngEPOsR分別注入正常大鼠玻璃體腔，注射前記錄FERG，注射后3d再次進(jìn)行FERG檢查及視網(wǎng)膜神經(jīng)元TUNEL凋亡原位檢測(cè)；注射

2、后7d進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和透射電鏡檢查。為了觀察內(nèi)源性EPO對(duì)RD后感光細(xì)胞的保護(hù)作用，2、20、200ngEPOsR分別注入大鼠RD模型玻璃體腔。RD后3d進(jìn)行TUNEL檢測(cè)及Western-blot方法和免疫熒光檢測(cè)Caspase-3活性；于RD后14d進(jìn)行組織病理學(xué)檢查及ONL厚度測(cè)量。EPO400ng注入大鼠玻璃體腔，以評(píng)價(jià)EPO的安全性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證EPO對(duì)脫離視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的保護(hù)作用，100、200、400ngEPO分別注入大

3、鼠RD模型玻璃體腔，于RD后3d進(jìn)行TUNEL檢測(cè)及EPOR、Caspase-3和Bcl-XL表達(dá)的檢測(cè)；于RD后第14d、28d、2個(gè)月進(jìn)行組織病理學(xué)檢查及ONL厚度測(cè)量。為了觀察EPO對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，400ngEPO注入大鼠RD模型玻璃體腔，采用Western-blot分別檢測(cè)JAK2、p-JAK2、Akt、p-Akt、ERK-1/2、p-ERK-1/2、STAT5、p-STAT5、NF-κB、P-NF-κB的表達(dá)水平。

4、 結(jié)果：RD后EPO和EPOR的mRNA表達(dá)均上調(diào)，均于RD后48h達(dá)到高峰。EPO和EPOR的mRNA表達(dá)水平分別于RD后12h、6h顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)：同樣EPO和EPOR的蛋白表達(dá)水平也呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，均于RD后3h顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。玻璃體腔注射EPOsR前后各組a波、b波的潛伏期及振幅無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；OPs的P4潛伏期和各子波總振幅也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；全層視網(wǎng)膜神經(jīng)元T

5、UNEL凋亡原位檢測(cè)未見(jiàn)凋亡細(xì)胞;光學(xué)顯微鏡和透射電鏡檢查均未見(jiàn)明顯組織病理性改變。RD后玻璃體腔給予EPOsR可加劇感光細(xì)胞凋亡，且具有劑量依賴性。Caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)與之相一致。14d時(shí)，正常對(duì)照組、RD組、RD+PBS組、RD+EPOsR2、20、200ng組ONL厚度分別為：(47.39±3.39)μm、(33.96±3.54)μm、(31.83±5.21)μm、(31.40±2.63)μm、(24.99±2.06

6、)μm、(19.30±3.71)μm；RD+EPOsR200ng組與其他各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。玻璃體腔注射EPO沒(méi)有改變視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能。RD后玻璃體腔補(bǔ)充重組大鼠源性EPO100、200、400ng可見(jiàn)凋亡細(xì)胞減少，且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。Caspase-3的活性呈現(xiàn)相應(yīng)趨勢(shì)。RD后14d，正常對(duì)照組、RD組、RD+PBS組、RD+EPO100、200、400ng組ONL厚度分別為：(45.70±1.53)μm、(35

7、.00±1.66)μm、(34.79±1.15)μm、(34.60±1.02)μm、(36.82±1.23)μm和(40.20±2.41)μm。RD后2個(gè)月，各組ONL厚度分別為：(46.744±1.97)μm、(14.51±1.42)μm、(14.70±1.19)μm、(18.17±1.23)μm、(26.28±4.25)μm和(34.00±2.40)μm。RD后14d及2個(gè)月感光細(xì)胞的內(nèi)外節(jié)的長(zhǎng)度及排列規(guī)則程度均優(yōu)于單純RD對(duì)照組。

8、Western-blot分析結(jié)果顯示RD后玻璃體腔補(bǔ)充外源性EPO對(duì)EPOR表達(dá)無(wú)影響，但可以抑制Caspase-3活性并增強(qiáng)Bcl-XL表達(dá)。RD后玻璃體腔注射外源性EPO對(duì)總JAK2、總Akt、總ERK-1/2、總STAT5、總NF-κB水平均無(wú)改變，但顯著增加了JAK2、Akt、ERK-1/2的磷酸化水平。 結(jié)論：RD后大鼠視網(wǎng)膜由于缺氧EPO和EPOR表達(dá)均增強(qiáng)，48h達(dá)到高峰，大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜大部分層次均能表達(dá)EPO和E