促紅細(xì)胞生成素對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元缺氧損傷保護(hù)作用的體外研究.pdf

1、目的：研究如何使視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞避免損傷或死亡即神經(jīng)保護(hù)，是眼科學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究的重要領(lǐng)域。近年來發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷后的生存、修復(fù)及預(yù)后有明顯保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)建立新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞原代混合培養(yǎng)體系和Müller細(xì)胞傳代培養(yǎng)體系，分析EPI及EPO受體在正常視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞以及低氧誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)，觀察缺氧損傷對(duì)培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元的影響，并探索EPO對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，

2、為EPO在視網(wǎng)膜疾病中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。 方法：將Wistar乳鼠視網(wǎng)膜通過胰蛋白酶+依地酸(EDTA)消化，制成視網(wǎng)膜單細(xì)胞懸液，建立一種穩(wěn)定、可靠的視網(wǎng)膜神經(jīng)元體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)的方法，并用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。低濃度氯化鈷預(yù)處理對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元進(jìn)行低氧預(yù)適應(yīng)，之后制作細(xì)胞急性缺氧模型。MTT檢測(cè)評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜神經(jīng)元急性缺氧損傷和低氧預(yù)適應(yīng)后細(xì)胞的活力改變。采用反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR法)、免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢

3、測(cè)EPO及EPO受體在正常視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞以及低氧誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)；從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、LDH釋放量等形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)，觀察不同濃度rhEPO預(yù)處理對(duì)視網(wǎng)膜缺氧損傷的保護(hù)作用。TUNEL染色檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和對(duì)照。此外，采用機(jī)械震蕩、吹打法培養(yǎng)和傳代視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞，3～4代的細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色，對(duì)缺氧條件下視網(wǎng)膜M(ü)ller細(xì)胞EPOmRNA和蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè)。 結(jié)果：

4、在多聚賴氨酸上培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞大多數(shù)抗NF抗體反應(yīng)陽性，NF陽性神經(jīng)元所占總數(shù)神經(jīng)元的90％以上。體外培養(yǎng)的正常視網(wǎng)膜神經(jīng)元有EPOR的表達(dá)。低氧預(yù)適應(yīng)后經(jīng)半定量RT-PCR分析，EPO基因表達(dá)在1h達(dá)最高峰，以后隨時(shí)間的延長(zhǎng)迅速下降，6h下降到接近正常的水平；而EPOR的表達(dá)在2h達(dá)到最高峰，約為正常對(duì)照組的4-5倍，以后雖然出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但仍一直維持較高水平，提示低氧預(yù)適應(yīng)后可上調(diào)神經(jīng)元EPO、EP

5、OR表達(dá)，這可能是機(jī)體發(fā)生內(nèi)源性視網(wǎng)膜保護(hù)的機(jī)制之一。同時(shí)，證實(shí)了外源性應(yīng)用重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)預(yù)處理對(duì)神經(jīng)元的缺氧損傷具有保護(hù)作用，在損傷前加入濃度在2.5-40U/ml的rhEPO均可有效抑制LDH釋放(P＜0.05)，而且具有濃度和時(shí)間依賴性；TUNEL結(jié)果顯示rhEPO預(yù)處理能抑制神經(jīng)元的凋亡。此外，成功獲得視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，傳代后的細(xì)胞GFAP染色表現(xiàn)為胞漿內(nèi)呈棕黃色的絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，陽性細(xì)胞在95％以上，并發(fā)

6、現(xiàn)在正常的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中僅見微弱的EPOmRNA和蛋白表達(dá)，而缺氧后表達(dá)明顯上調(diào)，這種上調(diào)呈時(shí)間依賴性。 結(jié)論：通過胰蛋白酶+EDTA聯(lián)合消化能很好得使視網(wǎng)膜細(xì)胞分離，視網(wǎng)膜神經(jīng)元體外培養(yǎng)成功，并有較好的視網(wǎng)膜神經(jīng)元生長(zhǎng)。體外培養(yǎng)的正常視網(wǎng)膜神經(jīng)元有EPOR的表達(dá)，低氧預(yù)適應(yīng)后能夠明顯上調(diào)視網(wǎng)膜神經(jīng)元EPO和EPOR表達(dá)，從而增強(qiáng)視網(wǎng)膜神經(jīng)元對(duì)急性缺氧損傷的耐受能力。rhEPO預(yù)處理抑制神經(jīng)元的缺氧損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，